СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКИХ МАСЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности, к гематологии и может быть использовано в профильных учреждениях для проведения дифференциальной диагностики хронических миелопролиферативных заболеваний на ранних стадиях развития патологического процесса.

Миеолопролиферативные заболевания /хронический миелолейкоз, сублейкемический миелоз и истинная полицитемия/ объединяет ряд клинико-морфологических признаков, которые на ранних этапах развития патологического процесса не могут быть приняты во внимание. В то же время необходимость раннего разграничения этих заболеваний продиктована различной тактикой терапии.

Наиболее широко распространенным методом дифференциальной диагностики миелопролиферативных заболеваний является трепанобиопсия с последующим гистологическим излучением костного мозга. Однако сходство гистологической картины на ранних этапах становления лейкозного процесса ограничивает диагностирование возможности этого метода.

Наиболее близким к заявленному методу по достигаемому эффекту является "Способ дифференциальной диагностики эритремии и вторичных эритроцитозов /А. с. 1232265, МКИ A 61 K 39/00: C 01 I 33/48, СССР, Заявл. 17.05.84, опубликовано 23.05.86, Бюл. N 9/путем исследования периферической крови при наличии признаков болезни, при котором выделяют из крови гранулоциты, определяют количество гранулоцитов, несущих рецепторы к Fc-фрагменту иммуноглобулинов и компонентам комплемента, и при увеличении их содержания по сравнению с нормой диагностируют эритремию, а при сохранении их содержания в пределах нормы диагностируют вторичный эритроцитоз.

Способ основан на учете функциональной активности нейтрофилов и рассчитан на проведение дифференциальной диагностики заболеваний опухолевой и неопухолевой природы. Кроме того, при проведении этого способа учитывается состояние рецепторного аппарата клетки и не принимаются во внимание другие параметры нейтрофила.

Цель заявляемого способа повышение точности дифференциальной диагностики.

Поставленная цель достигается тем, что при наличии признаков заболевания проводят выделение нейтрофилов венозной крови, определяют количество гранулоцитов, несущих рецепторы к Fc-фрагменту иммуноглобулина класса G и Cзв-компоненту комплемента, дополнительно определяют процент клеток, положительно реагирующих на мембранные оксидазы и поглощающих бактерии, рассчитывают сумму активных нейтрофилов на 100 клеток и при снижении этого показателя ниже нормальных величин диагностируют хронический миелолейкоз, при повышении истинную полицитемию и при сохранении этого показателя в пределах нормы диагностируют сублейкемический миелоз.

Способ осуществляют следующим образом: при поступлении больного в клинику наряду с общепринятыми гематологическими методами проводят забор венозной гепаринизированной /50 ЕД/мл/ крови, из которой центрифугированием /3500 об/мин в течение 30 минут в плотности фиколл-урографина /d 1,09 1,12 г/см³/ проводят выделение сегментоядерных нейтрофилов. Клетки трижды отмывают средой 199. Конечную концентрацию клеток доводят до 2,0•10⁶ к ток/мол.

1. Определение количества нейтрофилов, экспрессирующих рецепторы к Fc-фрагменту IоC, проводят с помощью моноспецифических антииммуноглобулиновых сывороток /Институт эпидемиологии и микробиологии АМН СССР им. Н.Ф.Гамалеи/ в реакции ЕА-образования /3/. Ход реакции: содержимое ампулы "диагностикума для определения ревматоидного фактора" /ГДР/ растворяли и трижды отмывали большим объемом среды 199 /8 10 мл/. Осадок ресуспендировали в 1 мл среды 199. Моноспецифические сыворотки против IоC человека пулировали в субагглютинирующем разведении, инкубировали при 37^oC с приготовленным раствором ДРФ в течение 30 минут. К 0,2 мл взвеси нейтрофилов добавляли 0,2 мл приготовленного раствора ДРФ, центрифугировали при 180 об/минуту в течение 5 минут. После ресуспендирования каплю взвеси переносили в камеру Горяева и подсчитывали процент клеток, присоединивших 3 и более эритроцита.

У здоровых лиц содержание нейтрофилов, несущих Fc-рецепторы составляло 75 86% при хроническом миелолейкозе 22 50% при сублейкемическом миелозе - 50 76% при истинной полицитемии 87 98%
2. Определение количества нейтрофилов, несущих рецепторы к Сзв-компоненту комплемента проводили по методу [2] эритроциты барана дважды отмывали в среде 199. К 0,2 мл взвеси добавляли 2,0 мл гемолитической сыворотки /Предприятие по производству бактерийных препаратов, г.Харьков/. Полученную взвесь инкубировали 30 минут при 37^oC, встряхивая каждые 5 7 минут. Недостаточную жидкость удаляли и к осадку добавляли 1 мл среды 199, после чего добавляли 0,1 мл сыворотки АВ/IV/ группы, инкубировали при 37^oC в течение 30 минут. После инкубации эритроциты барана дважды отмывали средой 199, удаляли надосадочную жидкость и к осадку эритроцитов барана добавляли 2,0 мл среды 199. В пробирку добавляют 0,2 мл взвеси нейтрофилов и 0,2 мл гемолитической системы, инкубируют при 37^oC в течение 30 минут, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1 минуты, осадок осторожно ресуспендируют, в камере Горячева подсчитывают 200 клеток. Те из них, которые присоединили 3 и более эритроцита барана, считают как нейтрофилы, несущие Сэв-рецепторы.

У здоровых лиц содержание нейтрофилов, несущих Сзв-рецепторы, составило 52 75% при хроническом миелолейкозе 20 44% при сублейкемическом миелозе 44 70% при истинной полицитемии 65 76%
3. Количество положительно-реагирующих нейтрофилов крови подсчитывали в мазках крови 4 после фиксации их в 60% растворе ацетона и окрашивании в течение 2-х часов при температуре 37^oC инкубационной смесью следующего состава:
НАДФН₂ 4 мг
0,1 М фосфатный буфер /pH 7,4/ 0,8 мл
НСТ / 1 мг/мл/ 1,0 мл
Дистиллированная вода до 2,0 мл
Активность мембранных оксидаз проявлялась в виде отложений гранул диформазана в цитоплазме нейтрофилов.

У здоровых лиц содержание клеток, проявляющих активность мембранных оксидаз, составило 30 55% при хроническом миелолейкозе 28 60% при сублейкемическом миелозе 44 70% при истинной полицитемии 65 80%
4. Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по количеству фагоцитирующих клеток [1] на 100 и выражали в процентах. Ход реакции: 0,2 мл гепаринизированной крови больного инкубировли с 0,2 мл взвеси микробных тел /micrococcus lysodeiticus/ при 37^oC. Через 15 минут инкубации при 37^oC готовили мазки, окрашивали их по Паппенгейму и микроскопировали.

У здоровых лиц содержание активно фагоцитирующих нейтрофил составляло 52 80% при хроническом миелолейкозе 15 35% при сублейкемичесмком миелозе 44 70% при истинной полицитемии 70 90% После проведения всех этих реакций рассчитывали сумму активных нейтрофилов на 100 клеток по формуле:

где: Fc-РОК количество нейтрофилов /розеткообразующих/, несущих Fc-рецепторы, СЗв-РОК количество нейтрофилов, несущих СЗв-рецепторы, ПРН-оксидазы положительно реагирующие нейтрофилы на мембранные оксидазы, АФН-количество активно фагоцитирующих нейтрофилов.

У здоровых лиц этот показатель колебания в пределах 2 2,7 при хроническом миелолейкозе 0,9 1,5; при сублейкемическом миелозе 2,36 - 2,7; при истинной полицитемии 2,9 3,2.

В качестве конкретных примеров осуществления способа приводим выписки из истории болезни. Во всех примерах у больных клинико-гематологические показатели /размеры селезенки, гемо-, миелограмма/ практически не отличались.

Пример 1. Больной Б-й, N ист. болезни 8864-1009 поступил в гематологическое отделение с жалобами на общую слабость, чувство дискомфорта в брюшной полости. При обследовании в гемограмме умеренный лейкоцитоз /19,0•10⁹/л/ со сдвигом в лейкоцитарной формуле до метамиелоцитов. Селезенка нижним полюсом на 4 см ниже реберной дуги. Наряду с общепринятыми клинико-гематологическими методами обследования проведено исследование функциональной активности лейкоцитов крови: количество Fc-РОК 25% СЗв-РОК - 24% содержание клеток, положительно реагирующих на мембранные оксидазы 48% количество активно фагоцитирующих нейтрофилов 30% Сумма активных нейтрофилов составила: 25 + 24 + 48 + 30/ 100 1,27. После детального клинического обследования больному был выставлен диагноз: хронический миелолейкоз.

Пример 2. Больная Г-к, N истории болезни 3451-314, поступила в гематологическое отделение с жалобами на общую слабость, боли ноющего характера в левом подреберье. При поступлении содержание лейкоцитов 16,2•10⁹/л, метамиелоцитов 6% палочкоядерных форм 36% сегментоядерных лейкоцитов 24% эозинофилов 2% базофилов 2% моноцитов 4% лимфоцитов 26% Наряду со стернальной пункцией и трепанобиопсией, больной проведено исследование функциональной активности нейтрофилов. Получены следующие результаты. Количество Fc-РОК 62% СЗв-РОК-78% количество положительно реагирующих на оксидазы нейтрофилов 48% количество активно фагоцитирующих клеток 55% Сумма активных нейтрофилов составила:
.

После получения данных трепанобиопсии /через 12 дней/ больной выставлен диагноз сублейкемический миелоз.

Пример 3. Больной К-ун, N ист. болезни 1195-153 поступит в гематологическое отделение с жалобами на утомляемость, чувство дискомфорта в брюшной полости. Анализ крови: Лейкоциты 13,2•10⁹/л, палочкооядерных форм 16% сегментоядерных 72% моноцитов 2% эозинофилов 2% лимфоцитов 8% Заподозрено миелопролиферативное заболевание. Проведена трепанобиопсия. Одновременно исследована функциональная активность нейтрофилов: количество Fc РОК-89% СЗв РОК-76% положительно реагирующих на мембранные оксидазы 52% фагоцитирующих нейтрофилов 72% Сумма активных нейтрофилов составила: 89% + 76% + 52% + 72%/ 100 2,89.

Апробация способа проведена на 148 больных миелопролиферативными заболеваниями, которые находились на лечении в гематологическом отделении Киевской областной клинической больницы.

Для оценки эффективности заявляемого способа проведен сравнительный анализ с результатами, полученными при использовании для дифференциальной диагностики миелопролиферативных заболеваний способа-прототипа / по количеству нейтрофилов, несущих мембранные рецепторы/. При применении способа-прототипа ошибка в дифференциальной диагностике составила 12% 16% / 18 человек из 148 больных/, тогда как при применении заявляемого способа процент ошибок составил 5,4% / 8 человек. Таким образом, точность способа была повышена в 2,25 раза.

Использование: в области медицины, в частности в гематологии. Сущность изобретения: при наличии признаков заболевания проводят выделение нейтрофилов венозной крови, определяют количество гранулоцитов, несущих рецепторы Fc-фрагменту иммуноглобулина класса G и C3в-компоненту комплемента, дополнительно определяют процент клеток, положительно реагирующих на мембранные оксидазы и поглощающих бактерии, рассчитывают сумму активных нейтрофилов на 100 клеток и при снижении этого показателя ниже нормальных величин диагностируют хронический миелолейкоз, при повышении - истинную полицитемию и при сохранении этого показателя в пределах нормы диагностируют сублейкемический миелоз. Способ позволяет повысить точность дифференциальной диагностики.

Способ дифференциальной диагностики хронических миелопролиферативных заболеваний путем выделения нейтрофилов венозной крови, определения количества гранулоцитов, несущих рецепторы к Fс-фрагменту иммуноглобулина класса G и СЗв-компоненту комплемента, отличающийся тем, что дополнительно определяют количество клеток, положительно реагирующих на мембранные оксидазы и поглощающих бактерии, рассчитывают сумму активных нейтрофилов на 100 клеток и при снижении этого показателя ниже нормальных величин диагностируют хронический миелолейкоз, при повышении истинную полицитемию и при сохранении этого показателя в пределах нормы диагностируют сублейкемический миелоз.