Способ определения функциональной активности Т-лимфоцитов-супрессоров Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

1

(21)4664988/14 (22) 22.03.89 (46)30.12.91. Бюл. №48

(71)Донецкий государственный медицинский институт им.М.Горького

(72)A.M. Гнилорыбов, В.В. Синяченко, В.Н. Сокрут, А.Н. Агеев и А.А. Заплотная (53)615.375(088.8)

(56)Петров Р.В., Лебедев К.А., Симонова А.В. Физиологии человека. - 1986, т.12, № 1, с.94-99.

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ Т-ЛИМФОЦИ- ТОВ-СУПРЕССОРОВ

(57)Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности Т-супрессоров и определения показаний к лечению больных средствами иммуномодулирующего действия. Целью изобретения является сокращение времени и повышение точности исследования. Поставленная цель достигается тем, что реакцию розеткообразования с эритроцитами барана ставят параллельно в 2 пробах с лимфоцитами, интактными и предварительно инкубированными в течение 40-42 мин с теофиллином. Подсчитывают розеткообразующие лимфоциты в мазках обеих проб с одновременным определением количества гранул сукцинатде- гидрогеназы в лимфоцитах, после чего вычисляют показатель функциональной активности супрессоров (СА) по формуле СА ДАт ДА (1-Тс) 100. где ДАт - активность дегидрогеназы лимфоцитов в мазках с ро- зеткообразующими клетками после 40-42 мин инкубации с теофиллином; ДА - активность дегидрогеназы лимфоцитов в реакции розеткообразования без предварительной инкубации лимфоцитов с теофиллином; Тс - общее количество Т-супрессоров, определенное в реакции розеткообразования. При значениях показателя функциональной активности супрессоров (СА) от 0,1 до 1,1 или от 2,0 до 10,0 диагностируют соответственно снижение или повышение функциональной активности Т-лимфоцитов. Использование способа возможно в любой иммунологической лаборатории, применяющей метод розеткообразования. Способ наряду с оценкой функциональной активности позволяет количественно определить уровень Т-супрессоров в крови, укорачивает время исследования до 1-2 сут(по прототипу 6-7 сут).

Ј

VJ

О

ю со

о

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности Т-лимфоцитов-супрессоров и выработки показаний к лечению больных.

Целью изобретения является сокращение времени и повышение точности определения.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Лимфоциты крови выделяют на градиенте плотности фиколл-верографина (р 0,077 г/л), дважды отмывают раствором Хэнкса, концентрацию клеток доводят до 2 106/мл

Готовят две пробы, I пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде № 199 в течение 40-42 мин при 37°С, затем отмывают забуференным физраствором.

В пробирки с 0,1 мл раствора, содержащего лимфоциты, предварительно инкубированные (I) и неинкубированные (нтактные) (II) с теофиллином, приливают 0,1 мл оаствора эритроцитов барана (5х х107/мл), инкубируют в термостате при 37°С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4°С) на 30 мин, затем осторожно фсуспендируют и делают мазки на тщательно отмытых стеклах.

В этот же день мазки после их высу- ц ивания окрашивают на активность сук- Цинатдегидрогеназы лимфоцитов. Перед Процедурой окраски готовят раствор сукци- ната натрия: к 2,95 г янтарной кислоты приливают 1 мл дистиллированной воды и 2 гидроокиси натрия, после растворения готовят 0,2 М раствор в дистиллированной воде. Растворяют0,013 г паранитротетразо- /1ия фиолетового в 10,0 мл дистиллированной воды, фильтруют, добавляют 0,015 г трилона Б, 10,0 мл фосфатного буфера (рН 7,4) и 10,0 мл 0,1 М раствора янтарно-кис- /joro натрия. После фиксации мазков в насы- 1 ценном растворе трилона Б в ацетоне (20 с) Дважды промывают в дистиллированной во- Де и инкубируют в приготовленной среде в течение 60 мин на водяной бане при 37°С, затем сушат и красят 1 %-ным водным рас- teopOM метилового зеленого (2 мин).

Подсчет розеткообразующих лимфоцитов (окруженных тремя и более эритроцитами барана) и лимфоцитов, розеток на Образующих производят путем микроскопии не менее 200 клеток в каждом мазке. Одновременно подсчитывают количество Гранул сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов. После этого определяют процент розеткообразующих лимфоцитов в пробах I и II, вычисляют количество Т-лимфоцитов-суп- рессоров по разности между процентом розеткообразующих лимфоцитов во II и I пробах, а затем рассчитывают супрессор- ную активность Т-лимфоцитов СА по формуле

СА ДАт/(ДА -(1-Тс/ЮО)). где ДАт - активность дегидрогеназы лимфоцитов в мазках с розеткообразующими клет- ками после 40-42 мин инкубации с теофиллином;

ДА - активность дегидрогеназы лимфоцитов в реакции розеткообразования без предварительной инкубации лимфоцитов с теофиллином;

Тс - количество Т-лимфоцитов-супрес- соров, определенное в реакции розеткообразования, и при значениях показателя супрессорной

активности (СА) от 0,1 до 1,1 или от 2,0 до 10,0 диагностируют соответственно снижение или повышение функциональной активности Т-лимфоцитов-супрессоров.

Пример 1. Исследуемый К., 26 лет,

0 практически здоров. Выделяют лимфоциты крови, взятой из локтевой вены, центрифугированием на градиенте плотности фи- колл-верографина (р 0,077 г/л), дважды отмывают раствором Хэнкса, концентра5 цию клеток доводят до 2 106/мл. Одну пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде № 199 в течение 40-42 мин при 37°С, затем отмывают забуференным физраствором. В пробирки с 0,1

0 мл раствора, содержащего лимфоциты, предварительно инкубированные (I) и неинкубированные (интактные) (II) с теофиллином, приливают 0,1 мл раствора эритроцитов барана (5- 10 /мл), инкубиру5 ют в термостате при 37°С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4°С) на 30 мин, затем осторожно ресуспендируют и делают мазки на тщательно отмытых стеклах.

0 После высушивания мазки окрашивают на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов по описанной методике. Подсчитывают розеткообразующие лимфоциты в I и II пробах (не менее 200 клеток в каждом маз5 ке). Выявлено розеткообразующих лимфоцитов в I пробе - 58, во II - 104. Подсчет Т-супрессоров проводят по разности между процентом розеткообразующих лимфоцитов во II и I пробах, т.е. (104/200) 1000 (58/200) 100 23 (%). Одновременно подсчитывают количество гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах I и II проб. Получены данные: в I пробе - 96, во II пробе - 82. Вычисляют супрессорную активность Т5 лимфоцитов по формуле

СА ДАт/(ДА (1 - Тс/100) 96/82 х х 1 -23/100) 1,5.

Делают заключение в нормальной суп- рессорной активности Т-лимфоцитов. Ак0 тивность супрессоров параллельно определяют в течение 7 сут, Индекс супрессии составил 36,5%, что также свидетельствует о нормальной функции Т- лимфоцитов-супрессоров.

5П р и м е р 2. Больная М., 46 лет. Диагноз: рак желудка, 3 стадии. Выделяют лимфоциты крови, взятой из локтевой вены, центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографина (р 0,777 г/л),

дважды отмывают раствором Хэнкса, концентрацию клеток доводят до 2 10 /мл. Одну пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде Ms 199 в течение 40-42 мин при 37°С, затем отмывают забуференным физраствором. В пробир,- ки с 0,1 мл раствора, содержащего лимфоциты, предварительно инкубированные (I) и неинкубированные (интактные) (И)стеофиллином, приливаютОЛ мл раствора эритроцитов барана (5- 10 /мл), инкубируют в термостате при 37°С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4°С) на 30 мин, затем осторожно ресуспендируют и делают мазки на тщательно отмытых стеклах. После высушивания мазки окрашивают на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов по описанной методике. Производят подсчет розеткообразующих лимфоцитов в I и II пробах (не менее 200 клеток в каждом мазке). Выявлено розеткообразующих-лимфоцитов в I пробе 78, во II - 110. Подсчет Т-супрессоров осуществляют по разности между процентом розеткообразующих лимфоцитов во II и I пробах, т.е. (110/200) 100- (78/200)- 100 16 (%). Одновременно подсчитывают количество гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах I и II проб. Получены данные: в I пробе - 105, во II пробе - 34. Вычисляют супрессорную активность Т-лимфоцитов по формуле

СА ДАт/СДА- (1-Тс/100)) 105/(34х х(1-16/100)) 3,7.

Делают заключение о повышенной суп- рессорной активности Т-лимфоцитов, функциональная активность Т-супрессоров параллельно определяла в течение 7 сут. Индекс супрессии составил 52,6%, что также свидетельствует о повышенной функции Т-лимфоцитов-супрессоров.

Пример 3. Больная С., 52 г. Диагноз: ревматизм, активная фаза, 2 степень активности, острая тромбоэмболия сосудов мозга.

Выделяют лимфоциты крови, взятой из локтевой вены, центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографина (р 0,077 г/л), дважды отмывают раствором Хэнкса, концентрацию клеток доводят до 2- 106/мл. Одну пробу лимфоцитов инкубируют в растворе теофиллина (3 мМ) в среде № 199 в течение 40-42 мин при 37°С, затем отмывают забуференным физраствором. В пробирки с 0,1 мл раствора, содержащего лимфоциты, предварительно инкубированные (I) и неинкубированные (интактные) (II) с теофиллином, приливают 0,1 мл раствора эритроцитов барана (5- 107/мл), инкубируют в термостате при 37°С в течение 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и ставят в холодильник (4°С) на 30 мин, затем осторожно ресуспендируют и делают мазки на тщательно отмытых стеклах. После высушивания мазки окрашивают на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов по описанной методике. Подсчитывают розеткообразующие лимфоциты в I и II

пробах (не менее 200 клеток в каждом мазке). Выявлено розеткообразующих лимфо- цитов в I пробе 134, во II - 152. Подсчет Т-супрессоров осуществляют по разности между процентом розеткообразующих лимфоцитов во II и I пробах, т.е. (152/200)- 100- (134/200)- 100 9 (%). Одновременно подсчитывают количество гранул сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах I и II проб. Получены данные: в I пробе -58, во II пробе 79. Вычисляют супрессорную активность Т- лимфоцитов по формуле

25

СА ДАт/(ДА- (1-Тс/100)) 58/(79х х (1-9/100)) 0,7

Делают заключение о снижении суп- рессорной активности Т-лимфоцитов, что явилось показанием для назначения имму- номодуляторов. При проведении лечения

тималином (иммуномодулятор) отмечено клиническое улучшение, что подтверждает результаты лечения. Функциональная активность Т-супрессоров параллельно определялась в течение 7 сут. Индекс супрессии

составил 5,2%, что также свидетельствует о снижении функции Т-лимфоцитов-супрессоров.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно сократить время,

необходимое для проведения исследования (с 7 до 1 сут). При проведении исследования не требуется соблюдения стерильных условий, что значительно облегчает работу. Предложенный метод более точен и позволяет диагностировать нарушения супрес- сорной активности лимфоцитов в тех случаях, когда по данным других методов изменения активности Т-супрессоров не выявляются. Применение метода возможно в

любой иммунологической лаборатории. При проверке предложенного метода по сравнению со способом-прототипом установлено повышение точности на 18%, что позволило повысить клиническую эффективность

лечения иммуномодуляторами больных, у которых были обнаружены изменения суп- рессорной активности Т-лимфоцитов только при исследовании предложенным методом.

7 17023168

Формула изобретенияподсчет розеткообразующих лимфоцитов в

мазках из обеих проб с одновременным опСпособ определения функциональнойределением количества гранул сукцинатдеактивности Т-лимфоцитов-супрессоров пу-гидрогеназы в лимфоцитах, после чего

тем постановки реакции розеткообразова-5 вычисляют соотношение активности сукциния с эритроцитами барана, о т л и ч а ю -натдегидрогеназы лимфоцитов, инкубирощ и и с я тем, что, с целью сокращенияванных и неинкубированных с теофиллином,

времени и повышения точности определе-и при значении показателя соотношения 0.1ния, реакцию ставят параллельно в 2-х про-1,1 определяют снижение супрессорной акбах с интактными лимфоцитами и10 тивности Т-лимфоцитов, а при значений

предварительно инкубированными в тече-2,0-10,0 определяют повышение супрессорние 40-42 мин с теофиллином, проводятной активности Т-лимфоцитов.