СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ОБРАЗОВАНИЯ АСЦИТНЫХ ФОРМ ГИБРИДОМ И УВЕЛИЧЕНИЯ ВЫХОДА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ Российский патент 1996 года по МПК C12N5/12 C12P21/08 

Изобретение относится к области биотехнологии, технологии получения препарата моноклональных антител (МКА).

Адъюванты это реактивные смеси, используемые в иммунологии для получения гипериммунных сывороток. С развитием гибридомной технологии они начали использоваться для получения асцитных форм гибридом. Адъюванты оказывают стимулирующее действие на процесс образования асцитных опухолей, вызывая раздражение брюшной стенки и наработку асцитного выпота в брюшную полость. Введение стимуляторов предотвращает врастание гибридомных клеток в стенку брюшной полости и образование солидных опухолей. В лабораторной практике наиболее часто используются такие стимуляторы, как пристан (Hoogenraad N. et al. J. of Immunol. Meth. 1983 v.61, p. 317). и неполный адъювант Фрейнда (Трофимова М. Н. с соавт. Биотехнология 1987. Т.3. N 6. - C.735-737). Пристан, или 2, 6, 10, 12-тетраметилпентадекан, представляет собой один из компонентов легкой фракции минерального масла и является препаратом, закупаемым по импорту. Он наиболее часто используется для получения асцитных форм гибридом, однако он не является адъювантом. Наиболее близким к изобретению аналогом является неполный адъювант Фрейнда. Неполный адъювант Фрейнда (НАФ) представляет собой смесь вазелинового масла с ланолином и твином-80, но введение его животным не всегда позволяет получить достаточно высокий титр моноклональных антител в асцитах. Стимуляторы вводятся внутрибрюшинно по 0,5 мл мышам линии BАLB/с за 7-14 дней до инокулирования гибридомных клеток. Пристан и НАФ высокоэффективные препараты при получении асцитных, а не солидных форм гибридом, однако из-за их токсического воздействия на клетки выход конечного продукта МКА невысок.

Для повышения выхода МКА предлагается стимуляция образования асцитных форм гибридом с помощью адъюванта ЦБА-A01, состоящего из липополисахарида сине-зеленых водорослей, вазелина, холестерина, твина и спана. Данный адъювант, так же как пристан и НАФ, является высокоэффективным препаратом при получении асцитных форм гибридом, но, кроме этого, он обеспечивает высокую концентрацию клеток и МКА в асцитической жидкости по сравнению с пристаном и НАФ. От наиболее близкого аналога НАФ адъювант ЦБA-A01 отличается по составу, дополнительно в него входят липополисахариды сине-зеленых водорослей и холестерин, которые оказывают ростостимулирующее действие на клетки гибридом.

Для подтверждения эффекта действия адъюванта ЦБА-A01 приводятся следующие примеры (табл. 1, 2).

Пример 1. Используют гибридому АР-FС-2В4, продуцирующую МКА к пероксидазе хрена. Клетки гибридомы, ресуспендированные в 3 мл раствора Хэнкса, вводят внутрибрюшинно мышам линии BALB/c в дозе 2х10 клеток на мышь. В качестве стимулятора роста асцитной формы опухоли применяют адъювант ЦБA-A01, используемый для получения гипериммунных сывороток. Срок преинъекции стимулятора 7 8 дней до инокулирования гибридомных клеток. Адъювант вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл на мышь. Продолжительность культивирования составляет 6 пассажей.

Все исследованные сенсибилизирующие агенты вызывают образование асцитической жидкости, содержащей МКА в 100% случаев. В результате введения индукторов гибели животных не происходит, что свидетельствует о малой токсичности адъювантов для мышей. Сравнение стимулирующего эффекта пристана и НАФ показало, что они обеспечивают сходную прививаемость гибридомных клеток, стимулируют образование асцита в одинаковые сроки и в одних и тех же объемах. Клетки нарастают до сходных концентраций, что отражается и на титре продуцируемых антител. Пассирование гибридомы на мышах с предварительным введением адъюванта ЦБА-A01 сопровождается значительным увеличением концентрации клеток в асцитической жидкости и соответственно более высоким титром МКА в асците.

Пример 2. Используют гибридому ИКО-20, продуцирующую МКА, выявляющие антиген Т10, экспрессированный на тимоцитах, небольшом проценте Т-клеток периферической крови, бластных клетках больных лейкозом. Гибридомные клетки ИКО-20 культивируют на мышах BALB/C с преинъекцией адъювантом ЦБА-A01 по примеру 1.

Предлагаемый способ стимуляции образования асцитных форм гибридом позволяет получить значительное увеличение концентрации гибридомных клеток в асцитической жидкости и соответственно более высокий титр МКА в асците при пассировании гибридом за счет преинъекции адъювантом ЦБА-A01, выпускаемым НПО "Биофармавтоматика" (Н. Новгород), которые используются для получения гипериммунных сывороток. ТТТ1 ТТТ2

Использование: биотехнология, получение моноклональных антител /МКА/. Сущность изобретения: использование адъюванта, состоящего из липополисахарида сине-зеленых водорослей, вазелина, холестерина, твина и спана, в качестве стимулятора образования асцитных опухолей гибридных клеток, продуцирующих МКА. Адъювант вводят за 7-8 дней до инокуляции гибридных клеток в количестве 0,5 мл на мышь. 2 табл.

Способ стимуляции образования асцитных форм гибридом и увеличения выхода моноклональных антител путем внутрибрюшинного введения адъюванта мышам линии Balbk, отличающийся тем, что используют адъювант, состоящий из липополисахарида сине-зеленых водорослей, вазелина, холестерина, твина и спана.