СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДРОФОБНОСТИ БЕЛКОВ Российский патент 1996 года по МПК G01N21/64 A23J1/14 A23J3/16 

Изобретение относится к физической химии высокомолекулярных соединений, а именно к определению гидрофобности белков, в том числе растительных соевых, широко используемых в пищевой промышленности, с помощью методов люминесценции.

Изобретение может быть использовано для прогнозирования и определения функциональных свойств белков, таких, как жироэмульгирующая и пенообразующая способность, существенно зависящих от гидрофобности белков, изменяющейся в процессе термической и ферментной переработки.

Известны способы оценки гидрофобности (ГФ) белков (1), например, методом хроматографии обратных фаз, связыванием белков углеводородами, гидрофобного распределения между двумя фазами, методом высаливания и измерения поверхностного натяжения, наконец, методом флуоресцентных проб.

Первые четыре способа весьма длительны, трудоемки и не имеют универсального характера.

Способ, основанный на методике флуоресцентных проб, более оперативен и реализуется последовательностью следующих существенных признаков:
1. В водный раствор белка вводят 8-анилино-нафталин-1-сульфонат (АНС).

2. Измеряют отношение интенсивностей флуоресценции АНС в растворе исследуемого белка и в растворе сывороточного альбумина в тех же условиях.

Основным недостатком известного способа является низкая точность количественных оценок ГФ, поскольку, как оказалось при дополнительных исследованиях, проведенных заявителем, интенсивность флуоресценции АНС зависит не только от гидрофобности белка, но и от наличия С=0 группировок, не включенных в систему водородных связей.

Задача, решаемая заявляемым изобретением, повышение точности количественной оценки ГФ белков.

Заявляемое изобретение способ определения гидрофобности белков - реализуется следующей совокупностью существенных признаков:
1. В раствор белка с концентрацией 0,2-2,0 мг/мл в 0,01-0,02 М боратном буферном растворе с рН=9,0-9,5, содержащем также 0,2-0,3 М NaCl, добавляют водный раствор акридинового оранжевого до рабочей концентрации (2-25)•10^-6 М.

2. Измеряют поляризацию флуоресценции рабочего раствора (Р₁) и определяют долю связанного белком акридинового оранжевого θ_I по соотношению:

3. Измеряют поляризацию флуоресценции (Р_ll) и рассчитывают долю связанного альбумином акридинового оранжевого в стандартном растворе сывороточного альбумина с той же концентрацией белка, буферного раствора и NaCl по соотношению

4. Величину гидрофобности (ГФ) определяют по соотношению:
ГФ = θ_I/θ_II (2).
Строение акридинового оранжевого:

Сравнение со способом-прототипом показало, что все указанные признаки являются отличительными.

Анализ известного уровня науки и техники показал известность способа определения неоднородности распределения винилацетатных звеньев в сополимере винилацетат виниловый спирт (2), где в качестве люминесцирующей добавки использовали водный раствор акридинового оранжевого. Целью этого известного решения являлось упрощение анализа структуры сополимера винилацетат - виниловый спирт и сокращение времени проведения анализа.

Известное изобретение отличается как решаемой задачей, так и совокупностью существенных признаков и достигаемой целью.

Известен также способ определения доли синдиотактических триад в полиметакриловой кислоте различной тактичности 3 с использованием водного раствора акридинового оранжевого с концентрацией 7•10^-4 М в бифталатном 0,05 М буферном растворе.

И это известное решение отличается от заявленного изобретения решаемой задачей, совокупностью существенных признаков и целью.

Как указывалось выше, все существенные признаки заявленного изобретения являются отличительными.

Анализ показал, что все признаки являются новыми, ранее не известными как по технической сущности, так и по свойствам тех признаков, которые включает в себя акридиновый оранжевый.

В заявленном изобретении использовано впервые обнаруженное свойство акридинового оранжевого в определенных условиях избирательно сорбироваться на гидрофобных участках белков, что ранее известно не было.

Соевые белки представляют собой многокомпонентные белковые смеси, выделяемые из соевого шрота. Для более эффективного практического использования соевых белков их подвергают частичному гидролизу с помощью ферментов щелочной протеазы или/и протосубтилина Г20Х. При этом модифицируются одновременно гидрофобность и ММ белков. От этих параметров зависят такие важные технологические характеристики белков, как жироэмульгирующая способность и стойкость образующейся эмульсии, пенообразующая способность и стойкость пены. Указанные величины характеризуются стойкостью эмульсии или относительным изменением объема полученной пены соответственно.

Известно, что указанные технологические характеристики являются функцией гидрофобности белков (1).

Все измеренные характеристики, указанные в дальнейшем (см. таблицы 1 и 2), представляют собой средние значения пяти измерений.

Установка для измерения поляризации флуоресценции (Р) описана ранее (4).

В таблице 2 представлены характеристики, полученные в условиях способа-прототипа.

Для лучшего понимания сущности заявленного изобретения приводим примеры конкретной реализации.

Пример 6.

К 2,0 мл 0,01 М раствора боратного буфера с рН 9,2 добавляют 2,0 мг сухого соевого белка (N 1), 23,2 мг (0,2 г) NaCl и 0,04 мл водного раствора акридинового оранжевого с концентрацией 10^-4 М, т.о. рабочая концентрация акридинового оранжевого 2•10^-6М.

Измеряют поляризацию флуоресценции рабочего раствора (Р₁) и определяют долю связанного белком акридинового оранжевого по соотношению:

θ_I = 0,33 при 1/P₁ 11,3.

К 2,0 мл 0,01 М раствора боратного буфера с рН 9,2 добавляют 2,0 мг сухого сывороточного альбумина человека, 23,2 мг NaCl (0,2 М) и 0,04 мл водного раствора акpидинового оранжевого с концентрацией 10^-4М.

Измеряют поляризацию флуоресценции акридинового оранжевого в растворе сывороточного альбумина (Р_II). Определяют долю связанного альбумином акридинового оранжевого по соотношению:

θ_II= 0,42 при 1/P_II 9,1.

Вычисляют величину гидрофобности (ГФ в) соевого белка N 1 по отношению: ГФ = θ_I/θ_II ГФ 0,33/0,42•100% 79%
Примеры 1-31 выполнены в условиях примера 6 и представлены в таблице 1.

Для сравнения в таблице 2 представлены значения ГФ (%) тех же белков, определенные по заявленному способу и по способу-прототипу с использованием 8-анилино-нафталин-1-сульфоната (АНС).

Концентрация белка 1 мг/мл; концентрация акридинового оранжевого 25•10^-6 М; концентрация АНС 10^-4 М.

Измерение проводят в 0,02 М боратном буферном растворе с рН 9,2 в присутствии 0,2 М NaCl.

Очевидно преимущество заявляемого изобретения, поскольку повышается точность измерения на интервал Δθ_Б измеряемой экспериментально доли связанного акридинового оранжевого, равный 0,13, приходится величина гидрофобности, равная 41% Т. о. на 0,01 Δθ_Б приходится более 3% ГФ.

В то же время на интервал интенсивности люминесценции по способу-прототипу, определяемый экспериментально и равный 38 относительным единицам, приходится величина гидрофобности, равная 10% Т. о. на 1 относительную единицу приходится 0,26% ГФ.

Кроме того, при анализе таблицы 2 хорошо видно, что практически отсутствует корреляция между величиной ГФ по способу-прототипу и такими показателями, как жироэмульгирующая способность и пенообразующая способность.

В то же время данные таблицы 1, основанные на заявляемом изобретении, подтверждают наличие такой зависимости.

Анализ данных таблицы 1 подтверждает существенность заявленных интервальных параметров.

Необходимо отметить, что отступление от заявленных параметров снижает точность определения ГФ.

Так, например, резко падает точность измерений при снижении рН до 8,5 или увеличении свыше 9,8-10,0.

Аналогично оказывает влияние увеличение концентрации NaCl до 0,4-0,5 М или снижение до 0,05-0,10 М. Снижает точность измерения уменьшение концентрации акридинового оранжевого до (5-10)•10^-7 М. Не повышает точность измерения увеличение концентрации до (5-10)•10^-5 М.

Использование: физическая химия. Сущность изобретения: в способе определения гидрофобности белка в водный раствор белка добавляют водный раствор акридинового оранжевого и измеряют поляризацию люминесценции раствора.

Способ определения гидрофобности белков, включающий добавление в водный раствор белка люминесцирующего красителя с последующим определением отношения характеристик люминесценции в растворе исследуемого белка и в растворе стандартного белка сывороточного альбумина, отличающийся тем, что в раствор белка с концентрацией 0,2 2,0 мг/мл в 0,01 0,02 М боратном буферном растворе с pH 9,0-9,5, содержащем также 0,2 0,3 M NaCl, добавляют водный раствор акридинового оранжевого до рабочей концентрации (2 - 25)•10^-6М, измеряют поляризацию люминесценции рабочего раствора (Р₁) и долю связанного белком акридинового оранжевого θ₁ по соотношению

в тех же условиях измеряют поляризацию люминесценции (Р_1i) акридинового оранжевого в стандартном растворе сывороточного альбумина и определяют θ_1i, затем определяют гидрофобность (ГФ) белка по соотношению ГФ=θ₁/θ_1i•100%.