Изобретение относится к биотехнологии и касается перевиваемых лимфобластоидных клеточных линий человека, которые могут быть эффективно использованы в медицинской вирусологии для изучения ВИЧ-инфекции in vitro.
Целью изобретения является получение штамма перевиваемых клеток человека CEM-K, устойчивых к заражению вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), с гиперэкспрессией антигена CD95 и отсутствием экспрессии антигена CD4 (CD95+CD4-).
Чувствительная к заражению ВИЧ-1 лимфобластоидная клеточная линия CEM вводится бестимусным мышам линии BalB/C (nude/nude). Суспензия клеток (107 клеток в 0,5 ml раствора Хенкса) подкожно инъецируется мыши в возрасте 2,5-3 мес. Через 3-4 недели, после возникновения опухоли на груди или брюшке, мышь забивается с помощью эфира. Таким способом с помощью последовательных пассажей на мышах, получен перевиваемый опухолевый штамм клеток CEM. После двадцатого пассажа на животных в стерильных условиях опухоль извлекается из-под кожного покрова и переводится в клеточную суспензию. Для этого применяют среды следующих составов. Среда N 1: RPMI 1640 с концентрацией 100 мкг/мл сульфата гентамицина и 300 мкг/мл L-глютамина. Среда N 2: содержит в соотношениях 1:1 среду N 1 и раствор версена с концентрацией 250 мг/л химопсина. Среда N 3: RPMI 1640, телячья эмбриональная сыворотка (ТЭС) 15% 100 мкг/мл сульфата гентамицина, 300 мкг/мл L-глютамина. Изолированную опухолевую ткань отмывают в среде N 1 и измельчают, дважды промывают средой N 1. Затем измельченную ткань заливают средой N 2 и помещают в термостат (Т 37oC) на 3-5 мин, после чего тщательно удаляют среду N 2. Измельченную опухолевую ткань помещают в стерильную посуду, заливают средой N 1 и активно встряхивают 10 мин. После этого клеточную суспензию сливают в центрифужную пробирку. Сбор клеточной суспензии повторяют 2-3 раза. Затем клеточную суспензию центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в среде N 3 и помещают во флакон для культивирования. При обязательном морфологическом контроле в течение 7-8 дн клеточная суспензия пассируется до утраты полиморфности.
Полученный клеточный штамм CEM-K характеризуется следующими признаками.
Морфологическая характеристика.
При электронномикроскопическом исследовании было показано, что по размерам и форме клеток и ядер полученные клетки соответствуют клеткам лимфобластоидного ряда. Клетки CEM-K имеют небольшой объем цитоплазмы, крупное округлое или многолопастное ядро, в некоторых случаях с нарушениями в перинуклеарном пространстве. В цитоплазме клеток обнаруживаются немногочисленные липидосодержащие включения, гипертрофированные митохондрии с нарушением морфологии внутреннего матрикса и структуры крист. Фоном служит электроннопрозрачная гиалоплазма с рибосомальными структурами. В ультратонких срезах не было обнаружено морфологических признаков контаминации бактериями, грибами, микоплазмами, простейшими.
Сведения о контаминации.
Поскольку одним из способов деконтаминирования клеточных линий является их пассирование на бестимусных мышах, то штамм клеток CEM-K характеризуется отсутствием какой-либо контаминации.
Стабильность полученного штамма.
Штамм клеток CEM-K выдержал 300 пассажей в культуре.
Культуральные свойства.
Среда для культивирования RPMI 1640 (производство Института полимиелита и вирусных энцефалитов, Москва), содержащая 7,5-15% ТЭС, 100 мкг/мл сульфата гентамицина и 300 мкг/мл L-глютамина. Необходимая концентрация CO2-3% Клетки растут в виде суспензионной культуры. Посевная доза 200 000 клеток, в миллилитре, кратность рассева 1:4, 1:5 через 3-4 дн.
Криоконсервирование.
Среда для замораживания RPMI 1640-40% ТЭС-50% глицерин 10% 1 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 0,5-1 см. Контейнер вносят в пары азота, а через двое суток в жидкий азот или низкотемпературный холодильник (-70 oC). Размораживание проводят, опуская пробирки в воду 36-38oC. Плеточную суспензию разводят средой RPMI 1640 и центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде в концентрации 500 000 клеток в миллилитре и помещают во флаконы для культивирования. Жизнеспособность после размораживания 50-85% (окраска 0,2% трипановым синим).
Цитогенетическое исследование клеток CEM-K.
Хромосомные препараты изготовлялись стандартным методом. G-окрашивание осуществлялось модифицированным методом Seabright M. (Seabright М. The use of proteolytic enzymes for the mapping of structural rearrangements in the chromosomes of man // Chromosoma. 1972. Vol. 35. p. 204-210). Модальный кариотип определялся путем подсчета хромосом на 100 метафазных пластинках. Количество полиплоидных клеток подсчитывалось путем анализа 1000 метафаз. Для выявления локализации ядрышковых организаторов некоторые препараты подвергались C-окрашиванию или окрашиванию нитратом серебра. Детальный цитогенетический анализ проводился на микрофото 15 G-окрашенных митофазных пластинок в каждой линии. Для родительской линии CEM и линии CEM-K были получены обобщенные реконструированные кариотипы (фиг. 1,2). Линия CEM характеризуется 2n=47 числом хромосом, тогда как линия CEM-K отличается возникновением полиплоидности: 2n= 90. Наблюдается появление дополнительных перестроенных хромосом (таблица 1).
Пример 1. Характеристики поверхностных антигенов клеток CEM-K.
Методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью панели моноклональных антител (МКА) к поверхностным антигенам лимфоцитов человека была определена экспрессия клеточных рецепторов исходной линии CEM и полученного штамма CEM-K. Суспензионные клетки трижды отмывали, а затем ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4), содержащем 21 ТЭС, 0,1% азида натрия и 0,01М HEPES. 500 000 клеток инкубировали с 50 мкл МКА в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки дважды промывали в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4). Затем клетки инкубировали с 20 мкл F(ab)-фрагментов 30 мин при 4oC, после чего дважды отмывали PBS и ресуспендировали в физиологическом растворе, содержащем 1% формалин. Подсчет производили на проточном цитофлюориметре FACScan (Becton Dickinson). Результат исследования представлен в таблице 2.
Пример 2. Заражение клеток CEM-K штаммами ВИЧ-1 H9RF и CEM/LAVBRU.
Чувствительность клеток CEM-K к заражению ВИЧ-1 определяли следующим образом. 0,5 мл осветленной центрифугированием культуральной жидкости клеток H9RF (TCID50-IO4) или CEM/LAVBRU (TCID50-0,58•104) инкубировали с 1•106 клеток CEM-K в течение 2 ч при 37oC. Для удаления вируссодержащего супернатанта центрифугировали при lOOOg 10 мин, после чего клетки ресуспендировали в 4 мл среды N 3 и переводили во флакон для культивирования. Аналогичным образом поступали с клетками CEM, которые служили контролем в данном эксперименте. Развитие инфекции оценивали в течение 7 дн. Вирусную репродукцию в двух клеточных линиях изучали 2-мя методами: ИФА (р24, "Вектор", Новосибирск) и реакцией обратной транскрипции (RT) по методу M.H.Lee (Lee М.Н. Sano К. Моrales F.E, lmagava D.T. Sensitive reverse transcriptase assay to detect and quantitate human immunodeficiency virus // J. of Clin. Microbiol. 1987. Vol. 25, N 9. P1717-1721.) на 3-й и 7-е сут после заражения. В линии CEM-K не обнаруживали развития инфекции (отрицательный сигнал в ИФА и тесте обратной транскрипции), тогда как в контрольных клетках CEM и на 3-й, и на 7-е сут наблюдали положительные сигналы в обоих тестах. Положительным контролем служили клетки хронически инфицированной линии H9RF. Результаты представлены в таблице 3.
Таким образом, впервые получен штамм перевиваемых лимфобластоидных клеток человека CEM-K с отсутствием экспрессии CD4 рецептора, утерявший чувствительность к заражению ВИЧ-1. Штамм характеризуется стабильным сохранением признаков, отличается от исходной линии CEM, клетки которой легко заражаются ВИЧ, гиперэкспрессией антигена CD95, полиплоидностью 2n 90, появлением дополнительных перестроенных хромосом и может служить моделью для исследования механизмов взаимодействия вируса иммунодефицита человека с клеткой-мишенью.
Использование: медицинская биотехнология, изучение ВИЧ-инфекции in vitro. Сущность: получен штамм перевиваемых лимфобластоидных клеток человека, устойчивый к ВИЧ-инфекции. Штамм получают путем последовательных пассажей чувствительной к ВИЧ-инфекции лимфобластоидной клеточной линии человека CEM на бестимусных мышах линии Balb/c. Штамм характеризуется возникновением полиплоидности (2n = 90), дополнительно перестроенными хромосомами, повышенной экспрессией антигена CD 95 и отсутствием экспрессии антигена CD 4 и служит надежной моделью для исследования механизмов взаимодействия вируса иммунодефицита человека с клеткой-мишенью. 3 табл., 2 ил.
Штамм перевиваемых клеток человека ГКВ СЕМ-К с гиперэкспрессией антигена CD9 5 и отсутствием экспрессии антигена CD4, устойчивый к ВИЧ-инфекции (CD
