СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСА КРАСНУХИ И ПОДДЕРЖИВАЮЩАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (ЕЕ ВАРИАНТЫ) Российский патент 1999 года по МПК C12N7/00 A61K39/20 C12N5/08 

Изобретения относятся к медицинской биотехнологии и могут найти применение при получении вакцинных и диагностических препаратов вируса краснухи.

Известен способ получения опытной серии культуральной вакцины против краснухи, предусматривающий заражение вирусом краснухи первично-трипсинизированных клеток почек двухнедельных кроликов с последующим культивированием вируса в поддерживающей питательной среде и сбором вирусной массы (См. В. Н. Мешалова. Опыт получения и аттенуации краснушного штамма "Орлов"/В кн.: Респираторные вирусные инфекции/ Тр. ИЭМ им. Пастера, Л. - 1973, т. XLII, с. 137 - 143).

Однако данный способ обеспечивает недостаточно высокий урожай целевого продукта из-за умеренной чувствительности клеточной культуры из почек двухнедельных кроликов. Урожай вируса краснухи на протяжении первых десяти пассажей составлял от 3,0 до 4,0 lg ТЦПД₅₀/0,5 мл. Кроме того, получение первично-трипсинизированной культуры клеток почек двухнедельных кроликов (ППК) связано со значительными затратами материальных средств на приобретение животных из специализированных хозяйств со сторого регламентированными условиями содержания и постоянным обследованием на отсутствие целого ряда вирусных и микробных агентов, а получение вирусных препаратов на ППК, в свою очередь, сопряжено с определенной трудоемкостью приготовления тканевого субстрата.

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является способ получения культуральной вакцины против краснухи, предусматривающий заражение вирусом краснухи диплоидной культуры клеток W1-38, полученной Хейфликом из легких эмбрионов человека, с последующим культивированием вируса в поддерживающей питательной среде (См. Plotkin S.A., Farquhar J., Katz M., Ingalls T. H. A new attenuated rubella virus groun in human fibroblasts: evidence for reduced nasopharyngeal extention. - Amer. J. Epidem., 1967, - 86, - p. 468 - 477, ). Однако урожай вируса краснухи (шт. RA 27/3) при этом не превышал 4,5 lg ТЦПД₅₀/0,5 мл. Кроме того, поступление в Россию зарубежных клеточных линий, перспективных для производства вирусных препаратов, весьма ограничено, а создание генофонда таких клеток, обеспечивающих коммерческое производство, практически невозможно. Несмотря на большое количество новых диплоидных линий и штаммов у нас в стране нет таких, которые были бы рекомендованы в качестве субстратов для получения культуральных краснушных вакцин и диагностических препаратов и могли бы обеспечить их коммерческое производство.

Известна поддерживающая питательная среда для культивирования вируса краснухи - среда 199 (Способ получения вакцины против краснухи. Патент N 4147772 США. Заявл. 29.07.67, Опубл. 03.04.79). Однако она не обеспечивает получение вируса краснухи с высоким титром инфекционной активности.

Наиболее близкой по сущности к заявляемой питательной среде является среда 199 с добавлением 5% аминопептида или 5% инактивированной телячьей сыворотки (См. Мешалова В.Н. "Опыт получения и аттенуации краснушного штамма "Орлов"/В кн.: Респираторные вирусные инфекции/ Тр. ИЭМ им. Пастера. - 1973. -т. XLII, с. 137 - 143). Добавление 5% аминопептида позволяет получить урожай, который однако не превышает 4,5 lg ТЦПД₅₀/0,5 мл. Добавление же 5% инактивированной телячьей сыворотки не обеспечивает достаточной чистоты конечного продукта, поскольку ее наличие в препарате вакцины является потенциальным аллергизирующим фактором для лиц, обладающих повышенной чувствительностью к чужеродному белку. Присутствие сыворотки (даже следовых ее количеств) в диагностических препаратах может послужить фактором, понижающим специфичность реакции. Кроме того, сыворотки животных могут быть контаминированы посторонними вирусными и микробными агентами.

Изобретения направлены на разработку способа получения вируса краснухи и поддерживающей питательной среды для его культивирования, при этом повышена биологическая активность препаратов вируса краснухи и обеспечена достаточная чистота конечного продукта за счет исключения аллергизирующего фактора.

Сущность изобретений сводится к следующему.

Способ получения вируса краснухи предусматривает заражение диплоидной клеточной культуры вирусом краснухи с последующим культивированием вируса в поддерживающей питательной среде. В качестве диплоидной клеточной культуры используют фибробласты легкого эмбриона человека - линия 385/13 (депонирована в базовом отделении Российской коллекции клеток в НИИ гриппа РАМН 24.04.94 г. под номером РКК(ДП)004, авторы: Литвинчук Л.Ф., Лисок Т.П., Шитикова Г.С.). Линия получена из легкого 17-18-недельного нормального эмбриона человека и криоконсервирована на 5-ом и 7-ом пассажах. Культивируется статическим и роллерным способами, имеет фибробластоподобный тип роста, ограниченный 50 пассажами срок жизни. Соответствие виду подтверждено кариологически; бактерии, грибы, микоплазмы не обнаружены; онкогенных потенций в тесте с использованием органной культуры кожи куриного эмбриона не выявлено.

Очевидно преимущество использования ФЛЭЧ для совершенствования технологии производства вакцины по сравнению с первично-трипсинизированными клеточными культурами вследствие простоты и экономичности первых из них, возможности всесторонней аттестованности в соответствии с требованиями Всемирной организации здравоохранения в отношении онкогенной безопасности, отсутствия посторонних контаминатов и стабильности биологических свойств клеточной линии. Кроме того в случае использования первично-трипсинизированной клеточной культуры ППК конечный продукт загрязняется балластными белками, образующимися в результате трипсинизации почечной ткани и достаточно прочно адсорбирующимися на поверхности культуральных флаконов.

Спектр чувствительности диплоидных клеточных культур к вирусу краснухи чрезвычайно разнообразен и может меняться в зависимости от используемого штамма вируса. Исследования, выполненные авторами, показали, что используемая ими в качестве субстрата для репродукции вируса краснухи диплоидная линия ФЛЭЧ-385/13 является наиболее чувствительной (концентрация вируса даже без предварительной адаптации к данной клеточной культуре достигает 4,5 - 5,0 lg ТЦПД₅₀/0,5 мл) из целого ряда исследованных клеточных культур, таких как почка эмбриона человека (ПЭЧ), кожно-мышечные фибробласты эмбриона человека (ФЭЧ), а также первично-трипсинизировнная почка новорожденного кролика (табл. 1).

За счет использования данной диплоидной линии удалось повысить биологическую активность препаратов вируса краснухи.

Поддерживающая питательная среда для культивирования вируса краснухи по первому варианту содержит среду 199 и аминопептид. Для повышения биологической активности препаратов вируса краснухи и повышения чистоты конечного продукта дополнительно ввели среду Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот и хлористый кальций при следующем соотношении ингредиентов, об.%:
Среда 199 - 40.....54
Среда Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 40....54
Аминопептид - 1.....5
Хлористый кальций - 5.....10
Прежде чем добавить в питательную среду раствор хлористого кальция, готовили его 2%-ный концентрат.

Согласно второму варианту к среде 199 добавили среду Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот, хлористый кальций и аргинин при следующем соотношении ингредиентов, об.%:
Среда 199 - 40.....54
Среда Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 40....54
Аргинин - 5.....10
Хлористый кальций - 1.....5
Перед добавлением в питательную среду аргинина, готовили его 2,5%-ный концентрат, хлористого кальция - 2%-ный концентрат.

В предложенных композициях питательных сред отказались от традиционно используемой в составе питательной среды, поддерживающей репродукцию вируса краснухи, эмбриональной телячьей сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота, поскольку данный компонент может служить фактором, способным вызывать нежелательные анафилактогенные реакции у лиц, обладающих повышенной чувствительностью даже к следовым количествам белка.

Для компенсации питательных веществ, содержащихся в сыворотке и позволяющих поддерживать репродукцию вируса на достаточно высоком уровне, включаются такие компоненты, как 2%-ный CaCl₂ (1-10%), 2,5%-ный аргинин (5-1%) и аминопептид (1-5%). Концентрация вируса в конечном продукте при этом достигает 5,5 - 6,0 lg ТЦПД₅₀/0,5 мл (табл. 2 и 3), что свидетельствует не только о компенсирующей роли вышеперечисленных компонентов питательной среды, но и об их стимулирующем действии на репродукцию вируса краснухи.

Способ реализуется следующим образом.

Пример 1. Культивирование вируса краснухи в статических условиях.

Матрасы объемом 250 мл с клеточной культурой ФЛЭЧ 385/13 трижды отмывают от сыворотки фосфатно-солевым буферным раствором, вносят по 5 мл поддерживающей питательной среды, содержащей расчетное количество посевного вируса.

Матрасы объемом 250 мл с клеточной культурой ФЛЭЧ 385/13 трижды отмывают от сыворотки фосфатно-солевым буферным раствором, вносят по 5 мл поддерживающей питательной среды, содержащей расчетное количество посевного вируса (множественность инфекции для штамма "Орлов-B" составляет 0,01 - 0,001 ТЦПД₅₀/клетку), проводят адсорбцию вируса в течение 1,5 часов при комнатной температуре, после чего добавляют по 35 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из
среды Игла МЕМ - 40%
среды 199 - 45%
аминопептида - 5%
2%-ного CaCl₂ - 10%
и по 250 мкг/мл стрептомицина и канамицина.

Зараженные клетки инкубируют при температуре 34-45^oC, ежедневно регистрируя состояние монослоя, развитие цитопатогенного действия вируса и делая сборы вируссодержащей культурной жидкости на 5, 8, 11, 14 день и т.д. полной деградации клеточного монослоя. Вирусные сборы охлаждают при 4 - 8^oC, а затем трехкратно замораживают в сухом льду со спиртом и оттаивают в водяной бане при 37^oC. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость вместе с отслоившимися пораженными клетками сохраняют от использования по назначению при температуре -20...-40^oC. Инфекционный титр вируса, определяемый титрованием на перевиваемой культуре клеток почек кролика RK13, равен 4,5 - 6,0 lg ТЦПД₅₀/0,5мл.

Пример 2. Культивирование вируса краснухи в роллерных условиях.

Роллерные флаконы объемом 1 или 3 литра с клеточной культурой ФЛЭЧ 385/13 трехкратно отмывают от сыворотки фосфатно-солевым буферным раствором, вносят по 10 или 30 мл, соответственно, поддерживающей питательной среды, содержащей 0,1 - 0,01 ТЦПД₅₀/клетку посевного вируса краснухи (шт. "Орлов-B"), проводят адсорбцию вируса в течение 1,5 - 2 часов при 37^oC, после чего добавляют по 90 или 270 мл, соответственно, поддерживающей питательной среды, состоящей из
среды Игла МЕМ - 45%
среды 199 - 40%
2,5%-ного аргинина - 10%
2%-ного CaCl₂ - 5%
и по 250 мкг/мл стрептомицина и канамицина.

Зараженные клетки инкубируют при температуре 34-35^oC на роллерной установке. При мере развития цитопатогенного действия вируса делают 3 - 4 сбора вируссодержащей культуральной жидкости, начиная с 50% вплоть до тотальной деструкции монослоя клеток. Вирусные сборы трехкратно замораживают в сухом льду со спиртом и оттаивают в водяной бане при 37^oC. Вируссодержащую культуральную жидкость освобождают от клеточного детрита центрифугированием в течение 1 часа при 3000 об/мин, добавляют стабилизатор и лиофилизируют или хранят при температуре -20...-40^oC. Контроль биологической активности вируссодержащей культуральной жидкости проводят на перевиваемой культуре клеток почек кролика RK13. Инфекционный титр вируса составляет 5,0 - 6,0 lg ТЦПД₅₀/0,5 мл.

Пример 3. Приготовление поддерживающей питательной среды
(вариант 1)
Для получения первого варианта поддерживающей питательной среды предварительно готовят 2%-ный (вес.%) раствор хлористого кальция на фосфатно-солевом буферном растворе, стерилизуют его автоклавированием и хранят при +4^oC в течение 6 месяцев. В среду Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот добавляют двойное количество глютамина. Смешивают все ингредиенты в следующей последовательности: среда Игла МЕМ (45%), среда 199 (40%), аминопептид (5%) и 2% CaCl₂ (10%). В готовую смесь добавляют по 250 мкг/мл стрептомицина и канамицина и вносят во флаконы с инфицированным монослоем клеток.

Пример 4. Приготовление поддерживающей питательной среды
(вариант 2)
Для получения второго варианта поддерживающей питательной среды предварительно готовят 2%-ный (вес.%) раствор хлористого кальция, как в примере 3. 2,5% (вес.%) раствор аргинина на фосфатном буферном растворе стерилизуют фильтрованием через миллипоровые фильтры и хранят при +4^oC в течение 6 месяцев. В среду Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот добавляют двойное количество глютамина. Смешивают все ингредиенты в следующей последовательности: среда Игла МЕМ (45%), среда 199 (40%), 2,5% аргинин (10%) и 2% CaCl₂ (5%). В готовую смесь добавляют по 250 мкг/мл стрептомицина и канамицина и вносят во флаконы с инфицированным монослоем клеток.

Таким образом, использование диплоидной клеточной культуры ФЛЭЧ 385/13 и предлагаемых составов поддерживающей питательной среды позволяет в 10 - 100 раз повысить урожай вируса краснухи, свободного от сывороточных компонентов, по сравнению с первично-трипсинизированной клеточной культурой почки 2-недельного кролика, а также другими диплоидными клеточными культурами, что дает возможность использовать, описываемый способ для получения биомассы вируса краснухи на стабильном, тщательно отконтролированном и доступном клеточном субстрате человеческого происхождения и применения полученного вирусного полуфабриката при изготовлении вакцинных и диагностических препаратов.

Изобретение касается получения вакцинных и диагностических препаратов вируса краснухи. Способ предусматривает заражение диплоидной клеточной культуры вирусом краснухи с последующим культивированием вируса в поддерживающей питательной среде. В качестве диплоидной клеточной культуры используют фибробласты легкого эмбриона человека ФЛЭЧ 385/13 (базовое отделение Российской коллекции клеток в НИИ гриппа РАМН, РКК(ДП)004). Поддерживающая питательная среда содержит среду 199, среду Игла с двойным содержанием аминокислот. Согласно первому варианту в нее добавлены аминопептид и хлористый кальций, а второму - аргинин и хлористый кальций. Изобретение повышает биологическую активность препаратов вируса краснухи и обеспечивает достаточную чистоту конечного продукта за счет исключения аллергизирующего фактора. 3 с. п.ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения вируса краснухи, предусматривающий заражение диплоидной клеточной культуры вирусом краснухи с последующим культивированием вируса в поддерживающей питательной среде, отличающийся тем, что в качестве диплоидной клеточной культуры используют фибробласты легкого эмбриона человека ФЛЭЧ 385/13 (базовое отделение Российской коллекции клеток в НИИ гриппа РАМН, РКК(ДП)004). 2. Поддерживающая питательная среда для культивирования вируса краснухи, содержащая среду 199 и аминопептид, отличающаяся тем, что дополнительно содержит среду Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот и хлористый кальций при следующем соотношении ингредиентов, об.%:
Среда 199 - 40 - 54
Среда Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 40 - 54
Аминопептид - 1 - 5
Хлористый кальций - 5 - 10
3. Поддерживающая питательная среда для культивирования вируса краснухи, содержащая среду 199, отличающаяся тем, что дополнительно содержит среду Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот, хлористый кальций и аргинин при следующем соотношении ингредиентов, об.%:
Среда 199 - 40 - 54
Среда Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 40 - 54
Аргинин - 5 - 10
Хлористый кальций - 1 - 5