СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2'-ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОЗИДОВ Российский патент 1997 года по МПК C12P19/38 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способам получения 2'-дезоксирибонуклеозидов. Дезоксирибонуклеозиды: тимидин (Т), 2'-дезоксиаденозин (дА), 2'-дезоксицитидин (дЦ) и 2'-дезоксигуанозин (дГ) находят широкое применение как полупродукты для синтеза лекарственных препаратов, в генной инженерии и биохимических исследованиях.

Наиболее близким техническим решением является способ получения 2'-дезоксирибонуклеозидов, предусматривающий гидролиз дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) экстрактом проростков ячменя или пшеницы при темпеpатуре 37 - 40^oС [1]
Раствор, содержащий ферменты, получают водной экстракцией проростков ячменя, пшеницы или бобов в весовых соотношениях (проростки: вода 1:1), к 160 л раствора рН среды в пределах 4,5 7,5 в течение 24 40 часов. В зависимости от условий проведения процесса и активности ферментов, содержащихся в экстракте, по данному способу достигается:
степень гидролиза ДНК до дезоксирибонуклеозидов 30 50%
содержание дезоксирибонуклеозидов в гидролизате 17 35% от веса ДНК.

Из 8 кг ДНК (88) получают:
дезоксиаденозина 250 г;
дезоксиуридина 300 г;
тимидина 300 г,
т.е. 21,3 дезоксирибонуклеозидов от веса ДНК.

К недостаткам способа относится:
низкая степень гидролиза ДНК до дезоксирибонуклеозидов и их низкое содержание в гидролизате за счет невысокой ферментативной активности экстрактов ячменя или пшеницы;
наличие в ферментативном экстракте дезаминаз, о чем свидетельствует полное превращение дезоксирибоцитидина в дезоксирибоуридин;
длительность проведения процесса гидролиза (24 40 часов) и содержание в гидролизатах ДНК больших количеств продуктов неполного гидролиза и негидрадированной ДНК, мешающих выделению и очистке конечных продуктов;
проведение гидролиза в низкой области рН (4,5 для диэстеразы), т.е. в области наименьшей растворимости субстрата.

Целью предлагаемого изобретения является увеличение выхода четырех дезоксирибонуклеозидов, увеличение степени гидролиза ДНК до дезоксирибонуклеозидов, сокращение длительности ферментолиза и удешевление технологического процесса получения дезоксирибонуклеозидов за счет экономии ферментов, этилового спирта и энергозатрат.

Указанная цель достигается тем, что в предлагаемом способе в качестве гидролизующего агента используют фильтрат культуральной жидкости Streptomyces coelicolor ЦМПМ-S-756 [2] содержащий ферментный комплекс 5'-экзонуклеазы и щелочной фосфатазы высокой активности (500 700 ед/мл по нуклеазе и 10 25 ед/мл по фосфатазе). Гидролиз осуществляют при температуре 37 40^oС в присутствии гидроксида кальция в концентрации, обеспечивающей поддержание рН среды в интервале 7,5 8,5.

В качестве субстрата используют ДНК различной степени полимерности и очистки: высокомолекулярную ДНК с содержанием основного вещества 60 дезоксинуклеопротеид (ДНП) с содержанием высокомолекулярной ДНК 36 и низкомолекулярную ДНК с содержанием основного вещества 62
При соотношении ферментов культуральной жидкости к основному веществу субстрата, равном 15000 20000 ед. активности нуклеазы и 450 550 ед. активности фосфатазы на 1 г основного вещества ДНК, время гидролиза составляет 4 5 часов. Процесс может протекать и при меньшей активности ферментов, но при этом возрастает время гидролиза и, как следствие, возрастает опасность инфицирования среды.

К фильтрату культуральной жидкости добавляют сухой препарат ДНК или ДНП, при этом рабочие концентрации составляют для ДНК 6% для ДНП 10%
Совокупность описанных факторов позволяет увеличить степень гидролиза препаратов ДНК до нуклеозидов до 81 88% для ДНК и до 90 95% для ДНП.

Содержание нуклеозидов в гидролизатах, полученных данным способом, составляет, дЦ 12 14; дА 29 34; Т 20 23; дГ 20 25 (по оптической плотности при 260 нм, данные ВЭЖХ).

В процессе гидролиза ДНК в качестве подщелачивающего агента используют гидроксид кальция, который необратимо связывает образующийся свободный неорганический фосфат и таким образом выводит его из среды ферментной реакции, что позволяет значительно снизить ингибирование фосфатазы свободным фосфатом. Применение гидроксида кальция позволяет стабильно поддерживать рН в диапазоне 7,5 8,5, что обеспечивает хорошее растворение ДНК, быстрое снижение вязкости раствора и синхронное действие нуклеазы и фосфатазы, в результате чего дезоксирибонуклеозиды образуются с высоким выходом.

Важным преимуществом заявляемого способа является то, что культуральная жидкость используемого актиномицета не содержит посторонних ферментов нуклеазного действия (дезаминаз, нуклеаз, РНК-аз и др.), поэтому нет необходимости получать ферментные препараты, очищать их, что связано с большими трудо- и энергозатратами (осаждение, лиофилизация, хроматография) и с большим расходом этилового спирта.

Очистку ферментативных гидролизатов от примесей высокомолекулярных веществ и солей проводят концентрированием гидролизатов и осаждением примесей этиловым спиртом. После хроматографического разделения четырех дезоксирибонуклеозидов получают 4 индивидуальных дезоксирибонуклеозида.

Пример 1.

К 2,5 л фильтрата культуральной жидкости Streptomyces coelicolor S-756 (активности: нуклеазы 700 ед/мл, фосфатазы 20 ед/мл) добавляют порциями при перемешивании 150 г высокомолекулярной ДНК (содержание основного вещества 60%) и 30 г гидроксида кальция. Гидролиз проводят при 37 39^oС и рН 7,5 8,5 в течение 5 часов. Содержание нуклеотидного материала в гидролизате (по данным полной разгонки пробы гидролизата на аналитической колонке с анионообменником АВ 17-2 составляет: сумма 4-х нуклеозидов 87,7% нуклеотиды 3,6% олигонуклеотиды 8,7% состав нуклеозидной фракции: дЦ 14,6% дА 36,3% Т 24,7% дГ 24,4%
Гидролизат нагревают до кипения, центрифугируют и супернатант отделяют. Шрот промывают 0,5 л горячей воды, смесь центрифугируют. Промывные воды присоединяют к основному фильтрату, шрот отбрасывают. Объединенный раствор с суммарной оптической плотностью 2,5х10⁶ оптических единиц (оп. ед.) концентрируют до 250 мл в вакууме при 55^oС.

Пример 2.

К 480 мл фильтрата культуральной жидкости (активность нуклеазы 670 ед/мл, фосфатазы 19,5 ед/мл) добавляют 28 г низкомолекулярной ДНК (содержание осн. вещества 62%), проводят гидролиз и очистку гидролизата аналогично примеру 1, время гидролиза 5 часов. Содержание нуклеотидного материала в гидролизате в сумма 4-х д-нуклеозидов 80,4, нуклеотиды 9,2, олигонуклеотиды 10,4. Состав нуклеозидной фракции в (260 нм) (дЦ 14,6, дА 36,2, Т 24,7, дГ 24,4). Раствор хроматографируют на колонке с анионообменником АВ 17-2, элюаты упаривают. Выход д-нуклеозидов после кристаллизации составляет: дЦ•НСl 1,1 г (70), дА 1,6 г (82), Т 1,2 г (60%), дГ 1,16 г (70).

Пример 3.

К 2,5 л фильтрата культуральной жидкости Streptomyces coelicolor S-756 (активность нуклеазы 650 ед/мл, фосфатазы 19 ед/мл) добавляют порциями при перемешивании 250 г дезоксинуклеопротеида (ДНП) (сод. основного вещества 36% ). Гидролиз проводят так же, как описано в примере 1, время гидролиза 4 час. Содержание нуклеотидного материала в гидролизате: сумма 4-х дезоксинуклеозидов 92% нуклеотиды 2,1, олигонуклеотиды 5,9. Состав нуклеозидной фракции, дЦ 14,8, дА 36,6, Т 24,0, дГ 24,6. Гидролизат очищают, затем проводят хроматографическое разделение д-нуклеозидов и их кристаллизацию, как описано в примере 1. Выход д-нуклеозидов на стадии кристаллизации: дЦ•НСl 9,0 г (78%), дА 11,4 г (83%), Т 8,6 г (65%), дГ 8,7 г (75%).

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: гидролиз дезоксирибонуклеиновой кислоты осуществляют ферментами культуральной жидкости Streptomyces coelicolor (ЦМПМ-S-756) в диапазоне рН 7,5 - 8,5 в присутствии гидроксида кальция в течение 4 - 5 часов с последующим выделением и очисткой 2'-дезоксирибонуклеозидов: тимидина, 2'-дезоксиаденозина, 2'-дезоксицитидина, 2'-дезоксигуанозина. В качестве субстрата используют ДНК различной степени полимерности и очистки: высокомолекулярную ДНК с содержанием основного вещества 60%, дезоксинуклеопротеид с содержанием высокомолекулярной ДНК 36% и низкомолекулярную ДНК с содержанием основного вещества 62%. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения 2'-дезоксирибонуклеозидов, включающий ферментативный гидролиз дезоксирибонклеиновой кислоты (ДНК) при 37 40 ^oC, выделение и очисту целевых продуктов, отличающийся тем, что гидролиз осуществляют ферментами, содержащимися в фильтрате культуральной жидкости Streptomyces coelicolor ЦМПМ-S-756, в присутствии гидроксида кальция в концентрации, обеспечивающей поддержание рН среды 7,5 8,5. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при отношении активности нуклеазы 15000 20000 ед. и активности фосфатазы 450 550 ед. на 1 г субстрата гидролиз проводят в течение 4 5 ч.