СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДА Российский патент 1997 года по МПК C12P19/30 

Изобретение относится к области микробиологии и инженерной энзимологии, а именно к способам получения дезоксирибонуклеотидов с помощью ферментов микроорганизмов, может быть использовано в микробиологическом производстве и медицинской промышленности.

Известен способ получения дезоксирибонуклеотидов, основанный на ферментативном гидролизе ДНК микробными нуклеазами [I]
Способ имеет следующие недостатки: 1) при действии на ДНК микробных нуклеаз получают смесь продуктов дезоксирибонуклеозидов, дезоксирибонуклеотидов и олигодезоксирибонуклеотидов, 2) суммарный выход 4-х 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-монофосфатов невысок, а при целевом получении индивидуального 2'-дезоксирибонуклеотида выход относительно субстрата (ДНК) составляет не более 15% 3) применяемый субстрат (ДНК), выделяемый из молок лососевых рыб, дорог и труднодоступен.

Известен способ получения дезоксирибонуклеотидов путем аэробного культивирования микроорганизмов, продуцирующих ферменты, расщепляющие ДНК, в присутствии ДНК, выделяемой также микроорганизмами. После культивирования по отдельности, а потом совместно, или сразу вместе указанных микроорганизмов на обычной питательной среде из культуральной среды выделяют образовавшиеся дезоксирибонуклеозиды, дезоксирибонуклеотиды и олигодезоксирибонуклеотиды. Этот способ целесообразно взять за прототип [2]
Прототип имеет следующие недостатки: 1) невысокий выход целевого продукта в связи с необходимостью выделения искомых 2'-дезоксирибонуклеотидов из смеси образовавшихся продуктов гидролиза ДНК, 2) трудоемкость способа, обусловленная необходимостью аэробного культивирования одновременно нескольких микроорганизмов с последующей существенной очисткой от присутствующих в культуральном бульоне соединений, 3) невысокая экономичность способа при необходимости направленного получения определенного дезоксирибонуклеотида.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение, повышение экономичности способа направленного получения индивидуальных (по основанию) 2'-дезоксирибонуклеотидов и увеличение выхода целевого продукта.

Принцип предлагаемого способа получения дезоксирибонуклеотидов заключается в осуществлении одностадийного процесса трансформации рибонуклеотида с заданным основанием в соответствующий дезоксирибонуклеотид с помощью пермеабилизованных клеток пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii. Ферментативное превращение осуществляется рибонуклеотидредуктазой, входящей в состав мембранного комплекса ферментов. Мягкая деструкция цитоплазматической мембраны снимает барьер проницаемости (пермеабилизация) и осуществляет доступность экзогенного субстрата (рибонуклеотида) к ферменту, в результате чего происходит его превращение в искомый дезоксирибонуклеотид, накапливающийся в инкубационной среде, содержащей только компоненты реакционной смеси.

Способ осуществляется следующим образом. Культуру Propioni-bacterium freudenreichii ssp. shermanii выращивают в течение 46 48 часов при 28-30^o без дополнительного аэрирования в среде известного состава. За 2 - 2,5 часа до окончания культивирования в культуру добавляют антибиотик блеомицетин в концентрации 0,00004-0,00005% Затем клетки отделяют от среды, ресуспендируют в калий-фосфатном буфере 0,08 0,1 М, рН 7,0 до 10 12% концентрации (по сухому весу) и пермеабилизуют тритоном Х-100 в концентрации 0,08-0,10% После чего клетки замораживают в жидком азоте в течение 10 12 минут, быстро размораживают при 30^o и обрабатывают глутаровым альдегидом в концентрации 0,08 0,10% После диализа клетки в концентрации 2,5 3,05 (по сухому весу) помещают в инкубационную среду состава, рибонуклеозид-5'-дифосфат 0,07 0,09; аденозилкобаламин 0,003 -0,005% дитиотреитол 0,40 0,47% остальное калий-фосфатный буфер 0,08 0,10 М, рН 7,0, и инкубируют при температуре 36 38^o в течение 2 3 часов, после чего 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-дифосфат (с заданным основанием) выделяют из среды.

Предлагаемый способ упрощен по сравнению с прототипом, так как не имеет операций совместного аэробного культивирования нескольких микроорганизмов и очистки выделяемых искомых продуктов от компонентов культуральной жидкости, обладает повышенной экономичностью в связи с использованием доступного и недорогого субстрата рибонуклеотидов, позволяющих в результате одностадийной трансформации направленно получать индивидуальный 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-дифосфат (с заданным основанием). Накопление 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-дифосфата составляет 0,45 -0,55 миллимолей в литре инкубационной среды (200 -250 мг/л), что составляет выход относительно субстрата 27 35% Что касается прототипа, то теоретически возможный выход одного индивидуального дезоксирибонуклеотида относительно ДНК не может превысить 25%
Пример 1.

Культуру Р. shermanii ВКМ-103 выращивают в течение 48 часов при 30^o без дополнительного аэрирования в среде следующего состава, глюкоза -2; сульфат аммония 0,3; калий фосфорнокислый (однозамещенный) 0,1; сульфат магния 0,02; гидролизат казеина (или триптон)- 0,2; мг/л хлористый кобальт - 3; сульфат марганца 5; хлористый натрий 5; хлорное железо 0,002; сульфат цинка 0,002; биотин 0,001; тиамин 0,2; патотенат кальция 1,0. Вода дистиллированная. Поддерживают значение рН 6,8-7,1.

За 2,5 часа до окончания культивирования в выросшую культуру добавляют антибиотик блеомицетин в 0,00005% концентрации. Затем клетки на холоде отделяют от среды и промывают калий-фосфатным буфером (0,03 М, рН 7,0) путем центрифугирования при 10,000 об/мин. Затем клетки ресуспендируют в калий-фосфатном буфере 0,1 М, рН 7,0 до 12% концентрации (по сухому весу) и в полученную суспензию добавляют тритон Х-100 в 0,10% концентрации, замораживают в жидком азоте (выдерживая 10 мин) и быстро размораживают при температуре 30^o. Далее в суспензию пермеабилизованных клеток добавляют 0,09% глутарового альдегида на 10 15 минут при 4 10^o, после чего ее диализуют против калий-фосфатного буфера (0,10 М, рН 7,0) в течение 14 -16 часов при 4 10^o (диализное соотношение 1:100). Обработанные таким образом клетки в концентрации 3% (по сухому весу) вносят в инкубационную среду следующего состава, аденозин-5'-дифосфат (АДФ) -0,09; аденозилкобаламин (АdoCbl) 0,005; дититреитол (ДТТ) 0,47; остальное калий-фосфатный буфер 0,10 М, рН 7,0, и инкубируют при 38^o 3 часа. Из литра инкубационной среды выделяют 250 мг 2'-дезоксиаденозин-5'-дифосфата, что соответствует выходу относительно субстрата 27%
Пример 2.

Культуру Р.shermanii ВКМ-103 выращивают, как указано в примере 1, 46 час при температуре 28^o.

За 2 часа до окончания культивирования добавляют антибиотик блеомицетин в 0,00004% Затем клетки отделяют от среды, промывают, как в примере 1, и ресуспендируют в 0,08 М калий-фосфатном буфере, рН 7,0 до 10% концентрации (по сухому весу). В полученную суспензию добавляют тритон Х-100 в 0,08% концентрации, затем ее замораживают в жидком азоте и быстро размораживают, как указано в примере 1. Далее в суспензию добавляют глутаровый альдегид в концентрации 0,08% и суспензию подвергают диализу, как указано в примере 1. Обработанные таким образом клетки в концентрации 2,5% (по сухому весу) вносят в инкубационную среду следующего состава, АДФ 0,07; AdoCbl 0,003; ДТТ - 0,40, остальное калий-фосфатный буфер 0,08 М, рН 7,0, и инкубируют в течение 2 часов при 36^o. Из литра инкубационной среды выделяют 225 мг 2'-дезоксиаденозин 5'-дифосфата, что соответствует выходу относительно субстрата 35%
Пример 3.

Культуру Р.shermanii ВКМ-103 выращивают, как указано в примере 1, 47 час при температуре 29^o. За 2,5 часа до окончания культивирования вводят антибиотик блеомицетин в концентрации 0,00004% Затем клетки отделяют от среды, промывают, как в примере 1, и ресуспендируют в калий-фосфатном буфере 0,09 М, рН 7,0 до 11% концентрации (по сухому весу). В полученную суспензию добавляют тритон Х-100 в 0,09% концентрации, затем ее замораживают в жидком азоте и быстро размораживают, как указано в примере 1. Далее в суспензию добавляют глутаровый альдегид в концентрации 0,085% и суспензию подвергают диализу, как указано в примере 1. Обработанные таким образом клетки в концентрации 2,7% (по сухому весу) вносят в инкубационную среду следующего состава, гуанозин-5'-дифосфат (ГДФ) -0,08; AdoCbl 0,004; ДТТ 0,044; остальное калий-фосфатный буфер 0,09 М, рН 7,0, и инкубируют в течение 2,5 часов при температуре 37^o. Из литра инкубационной среды выделяют 230 мг 2'-дезоксигуанозин-5'-дифосфата, что соответствует выходу относительно субстрата 29%

Использование: микробиология, инженерная энзимология.

Сущность изобретения: способ получения дезоксирибонуклеотидов, который осуществляется путем выращивания без дополнительного аэрирования бактерий Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii и отличается тем, что за 2 - 2,5 часа до окончания культивирования вносят антибиотик блеомицетин, затем клетки отделяют от среды, ресуспендируют в калий-фосфатном буфере, пермеабилизуют тритоном Х-100 с замораживанием в жидком азоте и быстрым оттаиванием, обрабатывают глутаровым альдегидом и после диализа помещают в инкубационную среду, содержащую определенный рибонуклеотид. После 2-3 часов инкубации соответствующие 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-дифосфаты выделяют из среды. Способ позволяет в результате одностадийной трансформации направленно получать индивидуальные 2'-деозксирибонуклеозид-5'-дифосфаты (с заданным основанием) с использованием ранее не применяемых в этих целях в биотехнологии более дешевых субстратов - рибонуклеотидов (выход относительно субстрата 25 - 37%).

1 Способ получения дезоксирибонуклеотида путем культивирования бактерий на питательной среде с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента берут Propionibacterium freudenreichii ssp. chermanii, их выращивают в течение 46 48 ч при 28 30<198>С, за 2,0 2,5 ч до окончания культивирования вносят антибиотик блеомицетин в концентрации 0,00004 0,00005% после чего клетки отделяют от среды, промывают и ресуспендируют в калий-фосфатном буфере 0,08 0,10 М, рН 7,0 до 10 - 12% концентрации (по сухой массе), пермеабилизуют тритоном Х-100 в концентрации 0,08 0,10% после чего клеточную суспензию замораживают в жидком азоте в течение 10 12 мин, размораживают при 30<198>С, обрабатывают глутаровым альдегидом в концентрации 0,08 0,09% и диализуют, после чего полученный биокатализатор помещают в инкубационную среду, содержащую рибонуклеозид-5'-дифосфат, кобаламин, восстановитель и буфер, и инкубируют в течение 2 3 ч при 36 - 38<198>С, после чего получаемый дезоксирибонуклеотид выделяют из среды.