Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы BaV В II Советский патент 1992 года по МПК C12N9/16 C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических работах и генно- инженерных исследованиях.

Рестриктазы II класса (синонимы: эндонуклеазы рестрикции, сайт-специфические эндонуклеазы), осуществляющие расщепление фосфодиэфирных связей ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям (сайтам), являются незаменимым инструментом исследования в практике молекулярно-генетических и. генно-инженерных работ, представляют собой уникальный объект для изучения природы и механизмов белково-нук- леиновых взаимодействий. Этими обстоятельствами и объясняется огромный интерес

исследователей в области биохимии, молекулярной биологии, микробиологии, вирусологии к выявлению продуцентов новых рестриктаз, разработке способов их очистки, изучению свойств, использованию в молекулярно-генетических экспериментах.

Рестриктазы выделены и частично или полностью охарактеризованы из более чем 1100 микроорганизмов самых различных таксонов /1/, Одна из рестриктаз, Asul, выделена из штамма Anabaena subcylindrica ССАР 1403/4В 111.

Эндонуклеаза рестрикции Asul расщепляет ДНК фага Я в 74 участках, ДНК аденовируса Ad 2 в 164, ДНК обезьяннего вируса SV 40 в II, ДНК фага$Х174 в 2 и плазмиду

Х| Os

00 О СО

pBR322 в 15, Фермент гидрслизует участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 ...GAGNCC...3

Содержание рестриктазы Asul в биомассе Anabaena subcyllndrica CCAP 1403/4В и выход очищенного от примесей неспецифических нуклеаз фермента не приводятся.

Целью изобретения является получение штамма бактерий, продуцирующих с высоким выходом новую рестриктазу Bav BII, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5 ... G CNCC ... 3.

Поставленная задача достигается тем, что биомассу B.alvei BKM В-674 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.

Рестриктаза Bav BII, изошизомер Asul, узнает и гидролизует участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 ... G GNCC ... 3. Эндонуклеаза рестрикции Bav BII расщепляет ДНК фага Я по 74 участкам, ДНК аденовируса Ad2 по 164, ДНК обезьяннего вируса SV40 по 11, ДНК фага0Х174 по 2 и плазмиду pBR322 по 15.

Поиск штамма-продуцента проводили с использованием экспресс-метода определения сайт-специфической энедонуклеаз- ной активности в толуольных лизатах микробных клеток с последующим электро- форетическим разделением вагарозном геле продуктов расщепления ДНК фага Я. Всего обследовано 18 штаммов Bacillus alvei.

Штамм B.alvei BKM В-674 получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов АН СССР, где хранится под № ВКМ В-674 NCI B8199 NRRLB-384

Характеристика штамма

Морфологические особенности. Палочковидные клетки, прямые или почти прямые, размером 0,5-0,8 х 2-5 мкм, подвижные (признак варьирует). Расположены поодиночке и парами, образуют споры. Грамположительны (признак непостоянный, варьирует Гр - Гр).

Культу рал ьно-биохимические свойства

На скошенном агаре - слабый, нежный налет. Колонии на МПА очень мелкие, блестящие, выпуклые с ровными краями.

На мясо-пептонном бульоне и бульоне Хоттингера - заметное равномерное помутнение, сероватая нежная пленка.

Отношение к кислороду - аэроб.

Каталаза - образует.

Утилизация углеводов - на глюкозе, лактозе, сахарозе образуют кислоту; на араби- нозе, ксилозе и манните кислоту не образуют. Крахмал - гидролизуют.

Лакмусовое молоко - свертывание, пеп- тонизация.

Индол и диоксиацетон - образуют.

Казеин - расщепляют. 0 Тирозин - не расщепляют,

Фенилаланин - не дезаминируют.

Оптимальные условия выращивания и хранения культуры.

Культура B.alvei BKM В-674 хорошо рас- 5 тет на жидких и твердых полноценных питательных средах- бульоне Хоттингера, среде LB, мясопептонном бульоне.

Максимальная и минимальная температура роста культуры соответственно 35-45° 0 С и 15-20° С, а оптимальная температура - 37° С. Оптимум роста рН 7,0-7-2. При рН 10 культура не растет.

Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу Bav BII, получают в том 5 случае, когда штамм-продуцент выращивают при 37° С в аэробных условиях в ферментере на питательной среде Хоттингера, которая содержит в 1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера; 10rNaCI;1 rK2HPO/i; 0 Н20 до 1 л. Выращивание прекращают через 3-4 в конце логарифмической фазы роста, когда рост достигает ,3-1,5. Выход биомассы 6,5-8,5 г/л. На среде рыбный экстракт (на основе гидролизата киль- 5 ки) культура растет медленно, а накопление активности рестриктазы в 3-4 раза ниже, чем при культивировании на средах LB или Хоттингера.

Ферментацию культуры проводят после 0 добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды.

Рабочие культуры пересевают на мясо- пептонный бульон или бульон Хоттингера один раз в 7-10 дней.

5 Хранят культуру а полужидком мясопептонном агаре под вазелиновым маслом в лиофилизированном виде в ампулах.

Культура непатогенна для мышей.

Выделение рестриктазы Bav BII прово- 0 дят фракционированием бесклеточных экстрактов изопропанолом и хроматографией на ионообменнике и аффинном сорбенте.

Инкубационная смесь для определения активности рестриктазы Bav BII, объемом 5 30-50 мкл, содержит: 0,01 М трис-HCI буфер, рН 7,5, 0,01 М MgCl2, 0,001 М дитиот- реитола (или 0,007 М 2-меркаптоэтанола), 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1 мкг ДНК фага А и 0,1-1,0 мкл фермента. Инкубацию проводят при 37° С в

течение 60 мин. Продукты расщепления ДНК фагаД анализируют электрофоретиче- ски в 0,8-1 % агарозном геле с последующим прокрашиванием геля в бромистом этидии. За единицу активности рестриктазы Bav BII принимают количество фермента (в мкл), которое за 1 ч инкубации полностью гидролизует 1 мкг ДНК фага при оптимальных условиях реакции.

Пример 1. Культура B.alvei BKMB-674 предварительно адаптируют на основной питательной среде, содержащей в 1 л: 250 мл перевара Хоттингера; 10 г NaCI; 1 г

К2НР04, ДО 1 Л ВОДЫ.

Инокулят для ферментера готовят, пе- ресевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10 и размножают в условиях аэрации.

Выращивание культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соот- ношении 1:10 к объему при температуре 37° С в аэробных условиях (1 л воздуха на 1 л питательной среды), рН среды 7,0. Во время выращивания рН культуральной жидкости поддерживают в интервале рН 7,2-7,5.

Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста.

Выход сырой биомассы составляет 6,5- 8,5 г/л культуральной жидкости.

Содержание рестриктазы Bav BII - 4 х 104 ед/г биомассы.

Выделение рестриктазы Bav Bil

10 г биомассы Bacillus alvei BKM В-674 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при +2-4° С. Остатки клеточных оболочек и неразрушенные клетки удаляют ультрацентрифугирова- нием, а бесклеточный экстракт

фракционируют изапропаколом. Обогащенный рестриктазой материал хроматографи- руют в калий-фосфатном буфере в градиенте КС на колонке с ДЭАЭ-целлюло- зой DE-52, а затем на колонке с голубой сефарозой CL-6B.

Получают 12 х 104 ед активности рестриктазы Bavls в 10 мл буфера с 50% глицерином. Выход очищенного препарата фермента 12 х 103 ед активности на 1 г сырого веса биомассы, Препарат рестриктазы Bav BI стабилен при хранении в течение 8-10 месяцев при температуре - 20° С.

Препарат фермента не содержит примесей фосфатаз, неспецифических эндонукле- аз и экзонуклеаз и пригоден для структурных исследований ДНК и генно-инженерных работ.

П р и м е р 2. Культивирование штамма Bacillus alvei BKM В-674 проводят аналогично описанному в примере 1 за исключением того, что в качестве питательной средь: используют среду LB, которая содержит в 1 л: 10 г триптона; 5 г дрожжевого экстракта; 5 г NaCi; до 1 л воды.

Выход биомассы 6-7 г/л культуральной жидкости.

Содержание ресгриктазы Bav BII 3 х 104 ед/г микробной массы.

После проведения очистки, как описано выше, выход рестриктазы Bav BII составляет 8 х 10 ед активности/г сырого веса биомассы,

Таким образом, по предложенному способу получают новую рестриктазу.

Формула изобретний

Штамм бактерий Bacillus alvei BKM B- 674 - продуцент рестриктазы Bav BII.

Использование: биотехнология и в мо- лекулярно-генетических работах и генноин- женерных исследованиях. Сущность изобретения: биомассу В alvei BKM В-674 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма бактерий В.alvei BKM В-674 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Bav В II, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 ... G CNCC ... 3 , в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы Bav BII в биомассе 3-4 х 10 ед/г сырой микробной массы. Для рестриктазы Asu I, изошизомера эндонуклеазы рестрикции Bav BII, содержание фермента в биомассе и выход очищенного препарата фермента не указаны. Выход очищенного препарата рестриктазы Bav BII составляет 8-12 х 103ед на 1 г сырой биомассы. Рестриктазы Bav BII не содержит примесей фосфатаз, неспецифических эн- донуклеаз и экзонуклеаз. V fe