Способ получения нуклеозидов Советский патент 1982 года по МПК C12P19/38 C12P19/38 C12R1/04 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОЗИДОВ

1

Изобретение относится к биохимии, а именно, к способу получения нуклеозидов, которые применяются в медицине и научных исследованиях.

Известен способ получения нуклеозидов, предусматривающий гидролиз РНК ферментными препаратами, содержащими нуклеазы и фосфатазы, при нагревании tl .

В качестве ферментных препаратов используют внутриклеточные ферменты, что усложняет процесс их получения. Кроме того, необходима активация ферментов, разрушающих нуклеозиды. Выход нуклеозидов составляет 51%.

Цель изобретения - увеличение выхода нуклеозидов и упрощение процесса.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения нуклеозидов, предусматривающем гидролиз РНК ферментными препаратами, содержащими

нуклеазь; и фосфатазы, при нагревании, в качестве ферментного препарата используют внеклеточные ферменты микроорганизма Actinomyces coelicolor А-18, при этом гидролиз ведут при , рН 8-9,1 в присутствии хлористого магния в концентрации Т-Ю 5-10 М, Штамм Actinomyces coelicolor А-18 зарегистрирован во ВНИИгенетика под коллекционным номером

10 ЦМПМ и имеет следующие морфологические и физиологические характеристики.

На твердой среде, содержащей осахаренные амилазой пщеничную муку и

15 крахмал, соли, мицелий имеет вид очень тонких разветвленных гид. Стенки клеток мицелия прямые. Ширина клеток мицелия 0,,93 ммк. Споро 2Q носцы спиральные, с 1-3 завитками, нередно с примитивными спиралями, расположенными моноподиально, одиночные. Споры.овальн&е, шаровидные, с гладкой оболочкой. Колонии неправильной округлой формы, края неровные, воздушный мицелий слабый, колонии серого или розовато-красного цвета. Диаметр гигантской колонии на 10-е сут рос та 10-12 мм. Среда не буреет, пи|- мент в среду не выделяется. На агаризованной среде Чапека с 3 сахарозы рост слабый, растет тонкой, помти прозрачной пленкой. Колонии круглые, поверхность ровная воздушный мицелий слабо развит, све ло-розового цвгта, диаметр колонии 6-7 мм. На крахмал-аммиачной среде рост слабый, тонкой пленкой, среда не окрашена, диаметр колонии 3- мм. На МПА образует небольшие колонии неправильной формы диаметром 7-8 мм,, растет в виде тонкой морщинистой пленки, в центре колонии сле ка выступающей над поверхностью агара Края колонии неровные, воздушный мицелий скудный, неокрашенный, среда не буреет. На сусло-агаре растет хорошо в виде мощной морщинистой пленки кремового цвета. Воздушный мицелий отсутствует, колонии круглые, края волнистые, диаметр 12-15 мм. На картофельно-пептонном агаре рост хороший, колонии в виде мЬрщи нистой пленки, окрашенные в красно вато-розоватый цвет. Края колонии волнистые, диаметр 6-7 мм, воздушны мицелий скудный белого цвета. На синтетической среде растет хорошо в виде небольших колоний диа метром 6-7 мм. Колонии гладкие, в центре слегка морщинистые, края неровные , колонии бесцветные или сле ка розоватые. На ломтике моркови рост слабый месте укола; на ломтике картофеля рост слабый, в верхней части столб ка в виде морщинистой пленки кремового цвета; мясо-пептонную желатину не разжижает; молоко хорошо пептонизирует на 10-е сут. Нитраты не восстанавливает. Оптимальная температура роста 37С - рост хороший в нижней части косяка в виде морщинистой пленки. При 50 - рост отсутствует. Отношение к углеводам: крахмал гидролизует, сахара употребляет с подкислением среды. Примерь 5л культуральной жидкости, полученной в результате 4 культивирования микроорганизма Actinomyces coelicolor A-l3 подвергают сепарации. Получают k л с: пернатанта с активностью нуклеазы 170 ед/мл. 100 г рибонуклеиновой кислоты растворяют в 1 л воды при п здщелачивании водным раствором аммиака до рН К полученному раствору РНК добавляют А л фильтрата культуральной жидкости и снова ДОЕЮДЯТ рН реакционной смеси до . Затем добавляют 5 г хлористого магния и устанавливают температуру регакционной среды . Выдерживают 10 ч при и 8,9-9,1 при постоянном перемешивании рН поддерживают добавлением раствора аммиаке. После окончания ферментативной гидролизат содержит, г: гуанозина 18,0, аденозина 15, цитидина , уридина И. Общее количество нучлеозидов, определенное методом ионообменной хроматографии, составляет 5б,1% от . РНК. П р и м е р 2. Используют супернатант, полученный как в примере 1, с нуклеазной активностью 300 ед/мл. 100 г рибонуклеиновой кислоты растворяют в 1 л воды при подщелачивании 2Н гидратом окис:и натрия до рН 8,7, добавляют k л супернатанта культуральной жидкости, полученному, как в примере 1, с активностью 300 ед/мл и снова доводят рН реакционной среды до 8,7Затем добавляют 5 г хлористого магния и выдерживают 6 ч при С и рН 8,5-8,7 при постоянном перемешивании рН поддерживают добавлением 2Н раствора гидрата окиси натрия. После окончания ферментативной реакции гидролизат содержит, г: гуанозина 18,8, аденозина 16,.цитидина , уридина 1,7. Общее количество нуклеозидов 58,71 от РНК. Предлагаемый способ позволяет увеличить выход нуклеозидов, упростить процесс получения и сократить его длительность. Формула изобретения Способ получения нуклеозидов, предусматривающий гидролиз РНК ферментными препаратами, содержащими нуклеазы и фосфатазы, при нагрева5 gjyiSft6

НИИ, отличающийся тем,рН 8,0-9,1 в присутствии хлористого что, с целью увеличения Выхода нук-магния в концентрации 5ЮЗ-ЫО м. леоэидов и упрощения процесса, в качестве ферментного препарата исполь-Источники информации, эуют внеклеточные ферменты микроорга-s принятые во внимание при экспертизе низма Actinomyces coelfcolor А-18,1. Патент Японии N 7-27037, при этом гидролиз ведут при ,кл. 16 Е 611.2, 1972.