СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОКОЛИЧЕСТВ РТУТИ Российский патент 1997 года по МПК G01N31/20 

Предлагаемое изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам определения микроколичеств ртути и может быть использовано для экспресс-анализа объектов окружающей среды.

Известны способы [1, 2] ферментативного определения ртути по ее ингибирующему действию на ферменты уреазу и холинэстеразу, заключающиеся в предварительной инкубации пробы с иммобилизованным ферментом и последующем определении скорости ферментативного гидролиза специфических субстратов - мочевины и эфиров холина соответственно с помощью потенциометрических датчиков. Указанные способы неселективны, требуют пробоподготовки и специального оборудования, включая ион-селективные датчики и ферментсодержащие мембраны.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по сущности и предлагаемому решению (прототипом) является способ [3] заключающийся в том, что к твердому раствору пероксидазы в хитозане, предварительно приготовленному смешением 0,1%-ного водного раствора хитозана и 2 • 10^-5 М раствора пероксидазы из корней хрена в объемном соотношении 10 1, дозированному и высушенному в ячейках полистирольного планшета для иммунохимического анализа, добавляют последовательно фталальный буферный раствор (рН 5,0) до полного растворения препарата фермента, 0,02 мл 2,5 • 10^-4 М раствора тиомочевины, инкубируют в течение 5 мин, затем добавляют 0,02 мл анализируемого раствора, содержащего ртуть, инкубируют смесь еще 10 мин, после этого добавляют 0,01 мл 2,5 • 10^-3 M раствора субстрата-восстановителя о -дианизидина, 0,01 мл 1 • 10^-2 M раствора пероксида водорода. Содержание ртути в пробе определяют визуально по зависимости времени достижения красно-коричневой окраски конечного продукта окисления о-дианизидина от логарифма концентрации ртути. Нижняя граница определяемых содержаний ртути 1 • 10^-5 мкг/мл. Время анализа составляет 20 мин.

Задача предлагаемого изобретения заключается в упрощении способа иммобилизации ферментного препарата пероксидазы, повышении чувствительности определения ртути, снижении продолжительности анализа.

Эта задача решается тем, что в процессе анализа к иммобилизованной в хитозане пероксидазе хрена последовательно добавляют раствор тиомочевины, анализируемую пробу, содержащую ртуть, растворы субстрата-восстановителя и пероксида водорода и фиксируют время достижения окраски продукта окисления, при этом в качестве носителя иммобилизованного ферментного препарата пероксидазы и одновременно подложки для проведения реакции используют хроматографическую бумагу, а в качестве субстрата-восстановителя 3,3',5,5' -тетраметилбензидин.

При использовании предлагаемого решения
1) упрощается способ иммобилизации ферментного препарата: смесь пероксидазы с хитозаном наносят на хроматографическую бумагу, отпадает необходимость использования и хранения полистирольного планшета. Активность пероксидазы в твердом растворе в хитозане на бумаге сохраняется в течение полугода (см. таблицу);
2) повышается чувствительность определения ртути за счет использования в качестве субстрата-восстановителя 3,3', 5,5' -тетраметилбензидина. Нижняя граница определяемых содержаний ртути составляет 1 • 10^-6 мкг/мл;
3) сокращается продолжительность анализа время определения ртути на бумаге составляет 5 мин. Это достигается за счет того, что отпадает необходимость инкубирования смесей компонентов реакции;
4) повышается контрастность перехода окраски реакционного раствора - голубая желтая, что облегчает визуальную индикацию завершения ферментативного процесса.

Выявленные отличия в аналитической химии и других смежных областях науки для указанных целей не использовались.

Предложенный способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для приготовления иммобилизованного препарата пероксидазы из хрена полоску хроматографической бумаги прямоугольной формы (6 х 8 48 см²) помещают в чашку Петри и пропитывают в течение 20 мин смесью 2 • 10^-5 M раствора пероксидазы в боратном буферном растворе, 0,1% раствора хитозана и воды в соотношении 7 2 1. После пропитки бумажную полоску высушивают в токе воздуха в течение 20 мин и разрезают на квадраты площадью 0,7 х 0,7 0,49 см². После этого в одну и ту же точку на поверхности бумажного квадрата вносят последовательно 4 мкл фталатного буферного раствора рН 5,0, 1 мкл 1 • 10^-3 M раствора тиомочевины, 1 мкл анализируемой пробы, содержащей ртуть, 2 мкл 2 • 10^-3 M 3,3',5,5' -тетраметилбензидина и 2 мкл раствора пероксида водорода. В момент введения пероксида водорода включают секундомер и фиксируют время достижения пятном желтой окраски. По полученным данным рассчитывают процент ингибирования пероксидазы по формуле:
ингибирования 100 t_к/t_пр • 100,
где t_к и t_пр время появления желтой окраски пятна в отсутствии (контрольный опыт) и в присутствии ртути (анализируемая проба) соответственно. Определение ртути в диапазоне концентраций 10^-6 - 10^-3 мкг/мл проводят по градуировочному графику, построенному в координатах: ингибирования пероксидазы логарифм концентрации ртути, линейному в соответствии с уравнением
ингибирования 169 + 30 lg c_Hg.

При концентрации ртути 1 • 10^-6 мкг/мл найдено (1,2 + 0,2) • 10^-6 мкг/мл при s_r 2,5 • 10^-7 (P 0,90, n 6).

Пример 2. Условия определения как в примере 1.

Концентрация ртути 1 • 10^-5 мкг/мл. Найдено (8,3 + 0,2) • 10^-6 мкг/мл при s_r 2,9 • 10^-6 (P 0,90, n 6).

Пример 3. Условия определения как в примере 1.

Концентрация ртути 2,8 • 10^-4 мкг/мл. Найдено (2,9 + 0,2) • 10^-4 мкг/мл при s_r 2,7 • 10^-5 (P 0,90, n 6).

Литература
1. Winquist F. Lundstrom K. Danielson B. Trace level analysis of mercury using urease in combination with an ammonia gas sensitive semiconductor structure.// Anal.Lett. 1988, V.21, N 10, p. 1801-1817.

2. Tran-Minh C. Immobilized enzyme probes for determing inhibitors. // Ion Selec.Electrode Rev, 1985, V.7, p.41-75.

3. Патент РФ. Кл. G 01, N 31/20. Способ ферментативного определения микроколичеств ртути. Долманова И.Ф. Никольская Е.Б. Шеховцова Т.Н. Чернецая С.В. Заявл. 29.05.92. N 5044717/3.

Назначение: аналитическая химия, а именно: к способам определения микроколичеств ртути и может быть использовано для экспресс-анализа объектов окружающей среды. Сущность: к иммобилизованному препарату пероксидазы последовательно добавляют растворы пероксидазы тиомочевины, анализируемой пробы, субстрата-восстановителя и пероксидазы водорода. При этом в качестве носителя иммобилизованного ферментного препарата используют хроматографическую бумагу, а в качестве субстрата-восстановителя - 3,3', 5,5' -тетраметилбензидин. В момент введения водорода начинают отсчет и фиксируют время появления желтой окраски пятна на бумаге. Определение ртути в интервале концентраций 10^-6 - 10^-3 мкг/мл проводят по градуировочному графику. 1 табл.

Способ ферментативного определения микроколичеств ртути, предусматривающий в процессе анализа последовательное добавление к иммобилизованному в хитозане ферментному препарату пероксидазы, помещенному на носитель, раствора тиомочевины, анализируемой пробы, растворов субстрата восстановителя и пероксида водорода, отличающийся тем, что в качестве носителя иммобилизованного ферментного препарата пероксидазы используют хроматографическую бумагу, а в качестве субстрата-носителя 3.3', 5,5-тетраметилбензидин.