Способ получения препарата фотосинтетических реакционных центров, содержащих фотоактивные цитохромы Советский патент 1990 года по МПК C12P21/00 

Изобретение относится к биохимии и биофизике и может быть использовано в биоэлектронике и биотехнологии, а также для исследования фундаментальных проблем фооосинтеза.

Целью изобретения является упрощение способа и увеличение выхода целевого продукта.

Изобретение иллюстрируется следую-, щими примерами

Пример 1. Клетки серных бактерий вида Chromatium minutissimum штамм № 1 или 1.1 выращивают фото- трофно на среде Ларсена 3-5 дней, собирают центрифугированием, замораживают. Размороженные клетки суспендируют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,0, содержащем 1 М этилендиаминтетрауксусной кислоты, озвучивают на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-1 при частоте 22 кГц, токе 0,4 А в течение 3 мин. Раствор центрифугируют 30 мин при 10000 g, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость центрифугируют при 144000 g 2 ч. Хроматофоры, полученные в виде осадка, суспендируют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7 и разводят до концентрации 400 мкМ бак- териохлорофилла, высаливают 70%-ным охлажденным ацетоном в присутствии дитионита натрия в концентрации 0,5 и центрифугируют при 1000 g в течение 5 мин. Осадок подсушивают на холоду и экстрагируют при 6 С в t 10 мМ фосфатном буфере рН 7,0, содер-. жащем экстрагирующий агент, указанный

О1

С& 4ь

СО

в первой колонке таблицы (концентрация этого агента указана во второй колонке). После 62 ч экстракции раствор доводят до 1% тритона Х-100 и центрифугируют при 2000 g-в течение 20 мин. Надосадочную жидкость наносят на колонку с гидроксилапатитом, уравновешенную 10 мМ Na-фосфатным буфером рН 7. Продукты деградации удаляют промыванием колонки 10 мМ Na-фосфатным буфером. Чистые фотосинтетические реакционные центры элюи- руют 10 мМ Na-фосфатным буфером рН 7, содержащим 0,05% тритона Х-100. Концентрацию фотосинтетических реакционных центров в исходном материале и конечном продукте определяют с помощью дифференциальной абсорбционной спектроскопии на длине волны 880 нм. Выход продукта рассчитывают по отношению абсолютного содержания фотосинтетических реакционных центров в конечном продукте к таковому в исходном материале. Величины выхода конечного продукта при различных способах экстракции показаны в таблице.

.холата натрия 0,1 - 0,2%-ного тритона Х-100 при разделении.белков фотосинтетических реакционных центров на колонке позволяет увеличить выход целевого продукта до 47-55% по сравнению с 15% в прототипе.

Предложенный способ является более простым, так как в нем отсутстJQ вует обработка мембран тритоном Х-100 разделение тритоновых комплексов на колонке с гидроксилапатитом, высаливание тритонового комплекса сульфатом аммония, высаливание фотосинтетичес15 ких реакционных центров с сульфатом аммония. Количество операций по сравнению с прототипом сокращено с 9 до 5 Целевой продукт сохраняет нативные свойства при получении предложенным

20 способом и является выеокоочищенным, что подтверждено данными электрофореза в полиакриламидном геле и абсорбционной спектроскопии.

25 Формула изобретения

Способ получения препарата фотосинтетических реакционных центров, содержащих фотоактивные цитохромы,

П р и м е р 2. Клетки серных бакте- включающий разрушение клеток пурпур- ных серных бактерий, отделение и со35

рий вида Ectothiorhodospira shapochni kovii штамм sp.l или шт. №1 выращивают фототрофно на среде Ларсена 7 - 10 дней, собирают центрифугированием, замораживают. Размороженные клетки суспендируют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,0, содержащем 10 3М этилен- диаминтетрауксусной кислоты, озвучивают на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-1 при частоте 22 кГц, токе 0,7 A.4Q Раствор центрифугируют 30 мин при 10000 g, осадок отбрасывают, а надо- садочную жидкость центрифугируют при 144000 g 1 ч. Остальные операции - как в примере 1

45

любилизацию хроматофоров, высаливание ацетоном фракции, обогащенной продуктом, экстракцию детергентом с последующей хроматографи шской очисткой на гидроксилапатите и элюцию целевого продукта, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода целевого продукта, солюбилизацию и высаливание фракции, обогащенной фотосинтетическими реакционными центрами, осуществляют одновременно, при этом ацетон используют в концентрации 60- 70% в присутствии дитионита натрия в концентрации 0,08-0,17%, экстракцию проводят смесью детергентов с конечными концентрациями тритона Х-100 0,05 - 0,2%, холата натрия 0,5-1% и дитионита натрия 0,17-34%, а элюцию проводят буферным раствором, содержащим тритон Х-ЮО в концентрации 0,05- 0,2%.

Предложенный способ является более эффективным, так -как использование 60-70%-ного ацетона (по сравнению с 90%-ным ацетоном в прототипе), 0,5-1%-ного холата натрия (по сравнению с 2%-ным холатом натрия) на стадии экстракции и вместо 2Ј-ного

.холата натрия 0,1 - 0,2%-ного тритона Х-100 при разделении.белков фотосинтетических реакционных центров на колонке позволяет увеличить выход целевого продукта до 47-55% по сравнению с 15% в прототипе.

Предложенный способ является более простым, так как в нем отсутствует обработка мембран тритоном Х-100, разделение тритоновых комплексов на колонке с гидроксилапатитом, высаливание тритонового комплекса сульфатом аммония, высаливание фотосинтетических реакционных центров с сульфатом аммония. Количество операций по сравнению с прототипом сокращено с 9 до 5. Целевой продукт сохраняет нативные свойства при получении предложенным

способом и является выеокоочищенным, что подтверждено данными электрофореза в полиакриламидном геле и абсорбционной спектроскопии.

Формула изобретения

5

0

любилизацию хроматофоров, высаливание ацетоном фракции, обогащенной продуктом, экстракцию детергентом с последующей хроматографи шской очисткой на гидроксилапатите и элюцию целевого продукта, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода целевого продукта, солюбилизацию и высаливание фракции, обогащенной фотосинтетическими реакционными центрами, осуществляют одновременно, при этом ацетон используют в концентрации 60- 70% в присутствии дитионита натрия в концентрации 0,08-0,17%, экстракцию проводят смесью детергентов с конечными концентрациями тритона Х-100 0,05 - 0,2%, холата натрия 0,5-1% и дитионита натрия 0,17-34%, а элюцию проводят буферным раствором, содержащим тритон Х-ЮО в концентрации 0,05- 0,2%.

51564190«

Концентрации детергентов, используемых для экстракции целевого продукта

Изобретение относится к биохимии и биофизике и может быть использовано в биоэлектротехнике и биотехнологии, а также для исследования фундаментальных проблем фотосинтеза. Цель изобретения - упрощение способа и увеличение выхода целевого продукта. Для этого мембраны пурпурных серных бактерий обрабатывают 60-70%-ным ацетоном в присутствии дитионита натрия в концентрации 0,08-0,17%. Затем осадок экстрагируют смесью ионного (хорат натрия) и неионного (тритон X-100) детергентов и дитионита натрия. Экстракт хроматографируют на колонке с гидроксилапатитом и элюируют тритоном X-100. При этом количество операций по сравнению с прототипом сокращается с 9 до 5. Целевой продукт сохраняет нативные свойства и является высокоочищенным, что подтверждено данными электрофореза в полиакриламидном геле и адсорбционной спектроскопии. 1 табл.