СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ БИОМАССЫ АЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПАТОГЕННЫМ МИКОБАКТЕРИЯМ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, касается способа оценки антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы аэробных бактерий и может быть использовано для отбора препаратов-пробиотиков медицинского и ветеринарного назначения.

Одним из показателей специфической активности пробиотиков и производственных штаммов для их изготовления является наличие антагонистического действия в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры.

Известен способ отсроченного антагонизма, когда подсев индикаторных штаммов на плотную питательную среду проводится через определенный период после посева испытуемой культуры [1].

Антагонистическую активность пробиотиков и бактериальных штаммов можно определить in vitro регламентированными способами, включающими совместное культивирование с индикаторными культурами в жидкой или на плотной питательной среде [2]. Определение антагонистической активности пробиотиков по отношению к индикаторным штаммам методом прямого антагонизма рассматривается нами в качестве предпочтительного аналога.

Общим недостатком известных способов является их неэффективность при определении антагонистической активности пробиотиков по отношению к микобактериям из-за особенностей биологии последних, касающихся скорости роста и требований к питательным средам, что затрудняет совместное культивирование с другими микроорганизмами.

Цель изобретения - повышение эффективности.

Поставленная цель достигается использованием для совместного культивирования среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин 0,4 г калий фосфорнокислый двузамещенный 0,05 г сернокислый магний 0,05 г лимонная кислота 0,2 г лимоннокислое аммиачное железо 0,005 г пируват натрия 0,05 г глицерин 4,0 г агар 3,0 г гумивит 10,0 мл водный раствор желтка куриного яйца (1:1) 10,0 мл дистиллированная вода до 100,0 мл

Причем исследуемый материал вносят в количестве 16-32% от общего объема среды, после чего пробирки прогревают на кипящей водяной бане в течение 5 минут, а антагонистическую активность оценивают по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением среды культивирования (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика (опыт).

Способ осуществляется следующим образом.

Ампулу с сухим пробиотиком вскрывают и регидратируют 0,9% раствором натрия хлорида. В стерильную пробирку с расплавленной и охлажденной до 70°С средой, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду, инокулируют пробиотик в количестве 16-32% от общего объема среды, пробирку прогревают на кипящей водяной бане в течение 5 минут, после чего среду скашивают, а затем на поверхность косячка осуществляют посев индикаторного штамма с последующим культивированием при температурном (37°С) и временном (30 дней) оптимуме. Контроль - косячки расплавленной и охлажденной до 70°С среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду, с добавлением среды культивирования.

Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 200 мл наливают 30,0 мл дистиллированной воды, прогревают на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяют последовательно 0,2 г лимонной кислоты, 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г сернокислого магния, 0,05 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 10,0 мл гумивита и 3,0 г агара. Каждый компонент добавляют после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов устанавливают рН 7,1-7,2 10% раствором натрия гидроокиси, общий объем доводят до 90,0 мл стерильной дистиллированной водой. Раствор автоклавировают в течение 30 минут при 1 атм. Свежие куриные яйца хорошо промывают в проточной воде, протирают 96° этиловым спиртом, разбивают в стерильных условиях и отделяют белок от желтка. В стерильной колбе смешивают желток и дистиллированную воду в соотношении 1:1 и 10,0 мл полученного раствора добавляют в расплавленную агаровую среду и перемешивают.

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром) представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот [3]. Раствор солей гумусных кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов [4, 5]. Гумивит - жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Исследования проводили с использованием пробиотического препарата окарин (ИмБио, г.Нижний Новгород), представляющего собой лиофилизированную биомассу живых микробных культур - представителей нормальной микрофлоры кишечника здорового человека, включающих три штамма кишечных палочек и фекальный энтерококк.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Определение антагонистической активности окарина (ИмБио, Нижний Новгород) по отношению к M.tuberculosis (шт.Academia), M.avium (шт.ГИСК), M.bovis (шт.Vallee, Ravenal).

Ампулу с сухим пробиотиком вскрывали и регидратировали 0,9% раствором натрия хлорида с температурой 15-20°С из расчета 1 мл на одну дозу препарата. Продолжительность регидратации при интенсивном встряхивании составляла 2-5 минут. В стерильную пробирку с 3,0 мл расплавленной и охлажденной до 70°С средой, содержащей 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,05 г сернокислого магния, 0,2 г лимонной кислоты, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 3,0 г агара, 10,0 мл гумивита, 10,0 мл водного раствора желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду (до 100,0 мл), инокулировали побиотик в количестве 20% от общего объема среды (0,6 мл), пробирку прогревали на кипящей водяной бане в течение 5 минут, после чего среду скашивали, а затем на поверхность косячка осуществляли посев индикаторного штамма с последующим культивированием при температурном (37°С) и временном (30 дней) оптимуме. Контроль - косячок (3,0 мл) расплавленной и охлажденной до 70°С среды, содержащей 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,05 г сернокислого магния, 0,2 г лимонной кислоты, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 3,0 г агара, 10,0 мл гумивита, 10,0 мл водного раствора желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду (до 100,0 мл) с добавлением казеинового бульона в количестве 20% от общего объема среды (0,6 мл). Количественную оценку проводили по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).

Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Оценка антагонистической активности окарина по отношению к патогенным микобактериям Пробиотический препарат Индекс блокирования роста* M.avium ГИСК M.tuberculosis Academia M.bovis Vallee M.bovis Ravenal Окарин в количестве 20% от общего объема среды 9 7 8 9 Примечание: отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).

Пример 2. Эффективность способа оценки антагонистической активности окарина (ИмБио, г.Нижний Новгород) по отношению к референс-штаммам M.tuberculosis (шт.Academia), M.avium (шт.ГИСК), M.bovis (шт.Vallee, Ravenal) в зависимости от количества пробиотика.

Схема оценки антагонистической активности как в примере 1. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Антагонистическая активность окарина по отношению к патогенным микобактериям Количество пробиотика, % от общего объема среды Индекс блокирования роста* M.avium ГИСК M.tuberculosis Academia M.bovis Vallee M.bovis Ravenal 4,0 2 1 1 1 8,0 3 2 2 2 16,0 9 7 8 9 32,0 9 8 8 9 Примечание: отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).

Пример 3. Эффективность способа определения антагонистической активности окарина (ИмБио, Нижний Новгород) по отношению к клиническим штаммам M.bovis (№2 и 3) и M.avium (№4), выделенным из лимфатических узлов крупного рогатого скота, в зависимости от количества пробиотика. Схема определения антагонистической активности как в примере 1. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 Антагонистическая активность окарина по отношению к патогенным микобактериям Количество пробиотика, % от общего объема среды Индекс блокирования роста* M.avium №4 M.bovis №2 №3 4,0 3 2 2 8,0 5 2 2 16,0 9 7 7 32,0 9 8 7 Примечание: отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).

Проведенные исследования подтвердили возможность оценки антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы аэробных бактерий способом в соответствии с изобретением. Полученные результаты свидетельствуют о сопоставимости показателей антагонистической активности пробиотиков по отношению к референс-штаммам и клиническим изолятам, полученным от крупного рогатого скота с подтвержденным диагнозом на туберкулез. Применение способа предполагает наличие параметров величины индекса блокирования роста и концентрации исследуемого материала для каждого препарата. Способ прост в осуществлении и может быть использован в качестве основного или дополнительного теста при определении антагонистической активности пробиотиков на основе бактерий и их метаболитов.

Источники информации

1. Бифидобактерин сухой. ФС 42-3947.12.07.2000

2. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. проф. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - С.341-343.

3. Гришин Г.И., Слинина К.Н. // Практик. - 2004. - №3-4. - С.80-82.

4. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Марков С.Е., 1999. - 198 с.

5. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфам / Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.

Исследуемую пробу пробиотика вносят в среду, содержащую L-аспарагин 0,4 г, калий фосфорнокислый двузамещенный 0,05 г, сернокислый магний 0,05 г, лимонную кислоту 0,2 г, лимоннокислое аммиачное железо 0,005 г, пируват натрия 0,05 г, глицерин 4,0 г, агар 3,0 г, гумивит 10 мл, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) 10,0 мл и дистиллированную воду до 100,0 мл в количестве 16-32% от объема среды. Затем пробирки прогревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин и скашивают среду. Засевают культуру индикаторного штамма на поверхность косячка и культивируют. Антагонистическую активность оценивают по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде с добавлением казеинового бульона в количестве 20%, к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде после внесения в нее пробиотика и прогревания. Это повышает эффективность способа прямого антагонизма. 3 табл.

Способ определения антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы аэробных бактерий по отношению к патогенным микобактериям, включающий внесение исследуемой пробы пробиотика в количестве 16-32% от объема среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорно-кислый двузамещенный, серно-кислый магний, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:
L-аспарагин 0,4, г калий фосфорно-кислый двузамещенный 0,05 г серно-кислый магний 0,05 г лимонная кислота 0,2 г лимонно-кислое аммиачное железо 0,005 г пируват натрия 0,05 г глицерин 4,0 г агар 3,0 г гумивит 10,0 мл водный раствор желтка куриного яйца (1:1) 10,0 мл дистиллированная вода до 100,0 мл,

прогревание на кипящей водяной бане в течение 5 мин, скашивание среды, посев культуры индикаторного штамма на поверхность косячка, культивирование при температурном и временном оптимуме с последующей количественной оценкой антагонистической активности по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде с добавлением казеинового бульона в количестве 20%, к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде после внесения в нее пробиотика и прогревания.