СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПАТОГЕННЫМ МИКОБАКТЕРИЯМ У МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И БАКТЕРИЙ ГРУППЫ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/08 C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к микробиологии, касается способа изучения взаимоотношений микроорганизмов и может быть использовано для выявления антагонистических свойств по отношению к патогенным микобактериям у молочнокислых бактерий и бактерий группы кишечной палочки.

Антагонизм микроорганизмов - взаимоотношения, при которых микроорганизмы одних видов подавляют развитие других, а иногда и полностью уничтожают их.

Известны способы выявления антагонистических свойств на жидких и плотных питательных средах, включающие совместное выращивание исследуемого и индикаторного штаммов с последующей оценкой [1], например, по антагонистическому индексу, по коэффициенту ингибирования, по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ), ингибирующих рост определенного количества индикаторного штамма [2]. Однако известные способы не позволяют выявлять антагонистические свойства по отношению к патогенным микобактериям из-за особенностей их биологии, касающихся скорости роста и требований к питательным средам, что затрудняет совместное культивирования с другими микроорганизмами.

Цель изобретения - способ выявления антагонистических свойств по отношению к патогенным микобактериям у молочнокислых бактерий и бактерий группы кишечной палочки на плотной питательной среде.

Поставленная цель достигается способом выявления антагонистических свойств по отношению к патогенным микобактериям у молочнокислых бактерий и бактерий группы кишечной палочки, включающим совместное выращивание исследуемого и микобактериального штамма на среде Сотона с последующим получением стерильного фильтрата культуральной жидкости, который наслаивают на плотную питательную среду перед посевом индикаторного штамма, причем антагонистическую активность оценивают по индексу блокирования роста.

Способ осуществляется следующим образом.

В 5 мл среды Сотона засевают 10 мкл суспензии исследуемого штамма, содержащей 5×10⁷ КОЕ в 1 мл. Пробирки с засеянным исследуемым штаммом помещают в термостат и выдерживают при температуре 37°С в течение 1 суток, затем засевают 10 мкл суспензии микобактериального штамма, содержащей 5×10⁷ КОЕ в 1 мл, помещают в термостат и выдерживают при температуре 37°С в течение 6 суток, после чего отделяют культуральную жидкость центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 минут, фильтруют через миллипоровые фильтры типа GS 0,22 мкм для шприцов. На поверхность плотной питательной среды (Левенштейна-Йенсена или Финн-2) в пробирке наслаивают 1 мл стерильного фильтрата культуральной жидкости и после впитывания засевают 10 мкл суспензии индикаторного штамма, содержащей 5×10⁷ КОЕ в 1 мл, помещают в термостат и выдерживают при температуре 37°С в течение 40 суток с последующим учетом выросших колоний.

В экспериментальных исследованиях использовали штаммы бактерий группы кишечной палочки Escherichia coli и Enterobacter faecalis (пробиотеческий препарат «Окарин» производства ИмБио, г.Нижний Новгород) и штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum 8P-A3 (пробиотический препарат «Лактобактерин» производства фирмы ИмБио, г.Нижний Новгород), штаммы микобактерий М.tuberculosis (Academia, Н₃₇Ра), М.bovis (Ravenal, Vallee, BCG), M.avium (ГИСК) и M.phlei (получены из ГИСК им. Л.А.Тарасовича, г.Москва).

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Обоснование выбора среды для совместного выращивания исследуемого и индикаторного штаммов.

В 5 мл среды Сотона и мясопептонного бульона (МПБ) засевали по 10 мкл суспензии четырех штаммов микобактерий (M.bovis шт.BCG и Ravenal, M.tuberculosis шт.Н₃₇Ra, M.avium шт.ГИСК), содержавшей 5×10⁷ КОЕ в 1 мл, с последующим высевом на среду Левенштейна-Йенсена трижды в течение 10 дней и выращиванием при температуре 37°С в течение 30 дней. Параллельно в 5 мл среды Сотона и МПБ засевали по 10 мкл суспензии исследуемых штаммов, содержавшей 5×10⁷ КОЕ в 1 мл, и выращивали при температуре 37°С в течение 4-5 дней. В случае исследуемых штаммов на обеих средах наблюдали рост, сопоставимый по густоте суспензии. В случае штаммов микобактерий при использовании МПБ способность вырастать на плотных питательных средах снижалась, и к 10 суткам при посеве 0,1 мл суспензии вырастали единичные колонии (1-3 колонии). При использовании среды Сотона через 10 дней после посева 0,1 мл суспензии отмечали выраженный рост колоний, сопоставимый по густоте с ростом после 7 дней выращивания на среде Сотона.

Пример 2. Выявление антагонистических свойств по отношению к патогенным микобактериям у молочнокислых бактерий.

Использовали штаммы Lactobacillus plantarum 8P-A3, в качестве индикаторных - штаммы Ravenal, BCG, Vallee (M.bovis) и штамм ГИСК (M.avium). В 5 мл среды Сотона засевали 10 мкл суспензии штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3, содержавшей 5×10⁷ КОЕ в 1 мл, а через 1 сутки выращивания при температуре 37°С - 10 мкл суспензии штамма M.avium шт.ГИСК, содержавшей 5×10⁷ КОЕ в 1 мл, с последующим выращиванием при температуре 37°С в течение 6 суток. Культуральную жидкость отделяли центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 минут и фильтровали через миллипоровые фильтры типа GS 0,22 мкм для шприцов.

На поверхность плотной питательной среды (Левенштейна-Йенсена или Финн-2) наслаивали 1 мл стерильного фильтрата культуральной жидкости и после впитывания в среду засевали 10 мкл суспензии индикаторного штамма, содержавшей 5×10⁷ КОЕ в 1 мл, помещали в термостат и выдерживали при температуре 37°С в течение 40 суток с ежедневным учетом выросших колоний в опыте и контроле. Контроль - пробирки с наслоенным стерильным фильтратом культуральной жидкости после выращивания штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3, засеянные индикаторными штаммами. Оценку результатов проводили по индексу блокирования роста (ИБР) - отношение количества колоний индикаторного штамма на плотной питательной среде к количеству колоний индикаторного штамма на плотной питательной среде с наслоенным стерильным фильтратом культуральной жидкости после совместного выращивания исследуемого и микобактериального штаммов (таблица 1).

Таблица 1.Антагонистические свойства по отношению к патогенным микобактериям у молочнокислых бактерийИсследуемый штамм Lactobacillus plantarum 8Р-А3ИБРM.bovis шт.RavenalM.bovis шт.BCGM.bovis шт.ValleeM.avium шт.ГИСКФильтрат культуральной жидкости после совместного выращивания штаммов Lactobacillus plantarum 8P-A3 и M.avium ГИСК на среде Сотона2,4±2,23,5±2,62,2±1,03,1±4,0Фильтрат культуральной жидкости после выращивания штамма Lactobacillus plantarum 8Р-А3 на среде Сотона1,2±0,61,2±0,60,5±0,20,14±0,1

Пример 3. Выявление антагонистических свойств по отношению к патогенным микобактериям у бактерий группы кишечной палочки.

Использовали штаммы Escherichia coli и Enterobacter faecalis, в качестве индикаторных - штаммы Academia (M.tuberculosis), Ravenal, BCG, Vallee (M.bovis) и штамм ГИСК (M.avium). Исследуемые штаммы выращивали на среде Сотона совместно со штаммом Academia (M.tuberculosis). Получение стерильного фильтрата культуральной жидкости, выявление антагонистических свойств к патогенным микобактериям и оценка результатов как в примере 2 (таблица 2).

Таблица 2.Антагонистические свойства по отношению к патогенным микобактериям у бактерий группы кишечной палочкиИсследуемые штаммы Escherichia coli и Enterobacter faecalisИБРM.bovis шт.RavenalM.bovis шт.BCGM.bovis шт.ValleeM.avium шт.ГИСКM.tubercul osis шт.AcademiaФильтрат культуральной жидкости после совместного выращивания штаммов Escherichia coli и Enterobacter faecalis и Academia (M.tuberculosis) на среде Сотона6,5±4,35,6±3,05,4±2,610,0±1,33,1±2,1Фильтрат культуральной жидкости после выращивания штаммов Escherichia coli и Enterobacter faecalis на среде Сотона4,6±0,21,0±0,81,3±0,93,2±0,22,0±0,1

Пример 4. Выявление антагонистических свойств по отношению к патогенным микобактериям у молочнокислых бактерий в зависимости от микобактериального штамма, используемого для совместного выращивания с исследуемым штаммом.

Использовали в качестве исследуемого штамм Lactobacillus plantarum 8Р-А3, в качестве индикаторного - штамм Ravenal (M.bovis), для совместного выращивания на среде Сотона - штаммы Academia (M.tuberculosis), BCG (M.bovis) и штамм ГИСК (M.avium). Порядок выявления антагонистических свойств и оценка результатов как в примере 2 (таблица 3).

Таблица 3.Антагонистические свойства по отношению к M.bovis (шт.Ravenal) у молочнокислых бактерий (шт.Lactobacillus 8Р-А3) в зависимости от микобактериального штамма, использованного для совместного выращиванияИндикаторный штаммИБРШтамм, использованный для совместного выращивания с исследуемым штаммомМ.bovis (шт.BCG)M.tuberculosis (шт.Academia)M.avium (шт.ГИСК)М.bovis (шт.Ravenal)2,4±2,22,4±2,32,2±2,1

Пример 5. Выявление антагонистических свойств по отношению к патогенным микобактериям у бактерий группы кишечной палочки в зависимости от микобактериального штамма, используемого для совместного выращивания с исследуемым штаммом.

Использовали в качестве исследуемых штаммов штаммы E.coli и Enterobacter faecalis, в качестве индикаторного - штамм Ravenal (M.bovis), для совместного выращивания на среде Сотона - штаммы Academia (M.tuberculosis), BCG (M.bovis), M.phlei и штамм ГИСК (M.avium). Порядок выявления антагонистических свойств и оценка результатов как в примере 2 (таблица 4).

Таблица 4.Антагонистические свойства по отношению к M.bovis (шт.Ravenal) у бактерий группы кишечной палочки (E.coli и Enterobacter faecalis) в зависимости от микобактериального штамма, использованного для совместного выращиванияИндикаторный штаммИБРШтамм, использованный для совместного выращивания с исследуемым штаммомМ.bovis (шт.BCG)M.tuberculosis (шт.Academia)M.avium (шт.ГИСК)М.phleiM.bovis (шт.Ravenal)6,0±1,06,5±4,112,0±2,55,0±2,0

Проведенные исследования подтверждают, что предложенный способ, включающий предварительное совместное выращивание исследуемого и микобактериального штаммов на среде Сотона, позволяет выявлять антагонистические свойства по отношению к патогенным микобактериям у молочнокислых бактерий и бактерий группы кишечной палочки. Совместное выращивание исследуемого и микобактериального штаммов стимулирует выработку веществ (бактериоцинов и/или колицинов), действующих против микобактерий, обусловливающих антагонистические свойства у молочнокислых бактерий и бактерий группы кишечной палочки, о чем свидетельствует отсутствие подавление роста индикаторного штамма, засеянного на поверхность плотной яичной среды с наслоенным на нее стерильным фильтратом культуральной жидкости, полученным после выращивания исследуемого штамма на среде Сотона. Предложенный способ может быть рекомендован для выбора пробиотического препарата для применения молодняку крупного рогатого скота, заражающегося патогенными микобактериями алиментарным путем в первые дни жизни, как средства лечебно-профилактического воздействия.

Источники информации

1. Ветеринарная энциклопедия: в 6 т. - М.: Сов. Энциклопедия, 1968. T.1 - С.266

2. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкин С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2004. - №5. - С.94-98.

Способ включает выращивание индикаторного штамма на плотной питательной среде и последующую оценку антагонистической активности. Исследуемый штамм выращивают совместно с микобактериальным штаммом на среде Сотона с последующим получением стерильного фильтрата культуральной жидкости. Фильтрат наслаивают на поверхность плотной питательной среды перед посевом индикаторного штамма. Антагонистическую активность оценивают по отношению количества колоний индикаторного штамма на плотной питательной среде к количеству колоний индикаторного штамма на плотной питательной среде с наслоенным стерильным фильтратом культуральной жидкости после совместного выращивания исследуемого и микобактериального штаммов. Способ позволяет выявить антагонистические свойства по отношению к патогенным бактериям у молочнокислых бактерий и бактерий группы кишечной палочки. 4 табл.

Способ выявления антагонистических свойств по отношению к патогенным микобактериям у молочнокислых бактерий и бактерий группы кишечной палочки, включающий выращивание индикаторного штамма на плотной питательной среде и последующую оценку антагонистической активности, отличающийся тем, что исследуемый штамм выращивают совместно с микобактериальным штаммом на среде Сотона с последующим получением стерильного фильтрата культуральной жидкости, который наслаивают на поверхность плотной питательной среды перед посевом индикаторного штамма, а оценивают антагонистическую активность по отношению количества колоний индикаторного штамма на плотной питательной среде к количеству колоний индикаторного штамма на плотной питательной среде с наслоенным стерильным фильтратом культуральной жидкости после совместного выращивания исследуемого и микобактериального штаммов.