СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ, ПОДДЕРЖИВАЮЩЕЙ И ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ РАЗВИВАЮЩИХСЯ ПРИ СТАРЕНИИ И/ИЛИ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ПАТОГЕННЫХ ФАКТОРОВ ПАТОЛОГИЙ, СВЯЗАННЫХ С ДИСТРОФИЧЕСКИМ И ДЕГЕНЕРАТИВНЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ Российский патент 1997 года по МПК A61K33/40 

Изобретение относится к медицине, преимущественно к лечению болезней, являющихся следствием старения, а также болезней связанных с ускоренным ослаблением функций органов и систем организма под влиянием острых или хронических патогенных воздействий. В частности, оно может быть использовано для восстановительной и превентивной терапии старческого слабоумия, в том числе сенильной деменции Альцгеймеровского типа (СДАТ).

На поведенческом уровне СДАТ характеризуется ослаблением памяти, прежде всего на текущие события, и прогрессирующим слабоумием, на морфологическом - гибелью значительной части нервных клеток в разных отделах мозга и дегенеративными изменениями нейронов и дендритов (Coleman P.D. Flood D.G. Neuron numbers and dendritic extent in normal ageing and Alzheimer's disease, Neurobiology of ageing, 1987, v.8, pp. 521 545. на физиологическом - дефицитами различных систем мозга (Greenamyre J.B. et.al. Alterations in L-glutamat binding in Alzheimer's and Huntington's diseases. Science, 1985, v. 227, pp. 1496 1499.

За рубежом в клинике болезни Альцгеймера используется препарат такрин (Summers W. K. et.al. New Engl.J.Med. 1986, v.315, N 20, p.1241), а во всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ разработан новый препарат амиридин (заявка СССР на изобретение N4076765 от 01.07.86 г. кл. A 61 K 31/47; патент США N 4735953, кл.514/313, 1988 г. патент ФРГ N 3231571, кл. A 61 K 31/47, 1988 г.).

Недостатком вышеуказанных препаратов является их сравнительно высокая токсичность, побочные эффекты холинэргической природы (тремор, диаррея, саливация), кроме того, токсическое действие такрина на печень при длительном применении. Основным же недостатком этих препаратов является заменительный, симптоматический характер терапии, не препятствующий прогрессирующему развитию собственно болезни.

Целью изобретения является устранение указанных недостатков.

Поставленная цель достигается применением тяжелой воды (D₂O) - природного стабильного изотопа обычной воды (H₂O) в качестве средства для терапии болезней старения и иных патологий, связанных с дегенеративными изменениями органов, которое предотвращает или замедляет дальнейшую деградацию клеток и восстанавливает их способность выполнять свои специализированные функции.

В данном изобретении терапевтический эффект достигается заменой в организме части обычной воды тяжелой водой.

Известно, что тяжелая вода, практически не отличаясь по своим физико-химическим свойствам от обычной воды, тем не менее оказывает изотопный эффект на биологические макромолекулы, заключающийся в стабилизации их нативной структуры (Лобышев В. И. Калиниченко Л.П. Изотопные эффекты D₂O в биологических системах, Москва, "Наука", 1978), выражающейся в повышении температуры денатурации белков и, соответственно, в увеличении среднего времени жизни белков (Hermans I.I. Scheraga H.A. The thermally induced configurational change of ribonuclease in H20 and D20. Biochem.et biophys.acta, 1959, v. 36, N 2, pp. 534 535).

Причиной деструктивных и дегенеративных изменений в органах и тканях организма, помимо старения, и может быть интенсивное и продолжительное воздействие патогенных факторов, вызывающих ускоренную потерю белков (бактериальные и вирусные инфекции, повышенная температура, интоксикации, радиация). Это означает, что предлагаемый метод может быть применим не только в случае ослабления функций, связанных с естественным старением, но и в случае ускоренного патологического старения, а также для лечения не старых больных, претерпевших сильное воздействие патогенных факторов и/или находящихся под их воздействием.

Таким образом критерии "новизна" и неочевидность обеспечиваются за счет неизвестного ранее из уровня техники применения D₂O как средства для лечения возрастных и иных патологий, характеризующихся потерей белка клетками и последующими дистрофическими и дегенеративными изменениями тканей.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

В качестве экспериментальной модели патологии старения нами было выбрано ослабление феномена длительной потенциации в нервных клетках гиппокампа старых крыс.

В качестве экспериментальной модели воздействия патогенных факторов была выбрана генерализованная бактериальная инфекция у взрослых крыс как при остром течении болезни (бактериальный шок), так и при хроническом течении (модель септического процесса), а также токсического шока.

Пример 1. Длительная потенциация (модель старения).

Адекватность выбора модели обоснована следующими факторами:
феномен ДП имеет отношение к функции памяти, являясь начальным этапом в цепи процессов, приводящих к формированию следов долговременной памяти, поскольку ослабление ДП сопровождается на поведенческом уровне ослаблением памяти, причем прежде всего на текущие события (Landfield P.W. Lynch G. Impaired monosynaptic potentiation of in vitro hippocampal slices from aged memory-deficient rats. J. Gerontology, 1977, v.32, N 5, pp. 523 533; Landfield P.W. Pilter T.A. Applegate M.D. The aged hippocampus: A model system for studies on mechanisms of behavioral plasticity and brain aging // The Hippocampus, 1986, v.3, pp. 323 367).

у старых животных наблюдается снижение количества различных белковых структур (Monaghan D. T. et al. Age dependent loss of NMDA receptors in rodent brains, Soc. Neurosci. Abstr. 1988, v.14, p. 486; Angeluoci L. Imperato A. Age-dependent loss of mucarinic receptors and cholinergic impairment in the rats brain, Neuroscience Letters, Suppl. 39, 1990, p.8),
отмечена связь между тяжестью слабоумия и снижением мембраной поверхностной плотности N-метил-D-аспартат рецепторов, ответственных за ДП, у больных СДАТ (Represa A. et al. Is senile dementia of the Alzheimer type associated with hyppocampal plasticity? Brain research, 1988, v. 457, pp. 355 359).

снижение суммарной скорости синтеза белка и, как следствие, дефициты различных белков и продуктов небелкового синтеза характерно не только для мозга, но и для всех органов и систем организма и являются наиболее достоверными фактами, касающимися старения, и признанными маркерами старения (Makrides S.C. Protein synthesis and degradation during ageing and senescence, Biol.Rev. 19836 v.58, 343 422; Rattan S.I. Ageind and disease: proteines as the molecular link, Perspect. Biol and Med. 1991, v. 34, N 4, pp 526 - 533).

Методы исследования. Опыты проведены на 20 старых (29 30 мес.) беспородных крысах самках. В течение 21 дня контрольная группа (9 крыс) пила обычную воду, а опытная группа (11 крыс) пила разбавленную D₂O. Проводилось контрольное взвешивание и визуальное наблюдение за их проведением. Затем 6 дней обе группы получали обычную воду с тем, чтобы "вымыть" тяжелую воду из организма и поставить обе группы в равные условия в последующих экспериментах. После этого эксперимент проводился следующим образом: ежедневно брали одну контрольную или одну опытную крысу (попеременно), наркотизировали уретаном (1,3 г/кг), декапитировали и выделяли срезы гиппокампа, которые переносили в специальную термостатируемую камеру, где их инкубировали в течение опыта.

Через камеру со скоростью 2 мл/мин пропускали физраствор (состав в мМ: NaCl-124, KCl-5,0; CaCl₂-2,5 MgSO₄-2,4; KH₂PO₄-1,25; NaHCO₃-26, глюкоза-15; pH=7,4 7,5;), насыщенный карбогеном (95% O₂ и 5% CO₂). 20 30 мин срезы выдерживали при комнатной температуре, затем температуру поднимали до 28 - 29^oC. Регистрацию электрической активности начинали через 1 1,5 часа после приготовления срезов. Регистрирующие стеклянные микроэлектроды, заполненным 2M цитратом Na, сопротивлением 5 25 Мом помещали в слой пирамидных нейронов. Электрическую стимуляцию коллатералей Шаффера осуществляли через двуствольные стеклянные микроэлектроды, заполненные физраствором сопротивлением до 2 Мом импульсами прямоугольной формы (амплитуда до 40 В, длительность 0,2 м/сек, частота 0,2 0,3 Гц). Обработка полученных данных производилась на ЭВМ "Электроника Д3-28").

Результаты исследования. В среднем в контрольной группе вес животных составил: в 1-ый день 365±37 грамм, 21 день 380±38 грамм. В опытной группе: в первый день 373±25 грамм, 21 день 375 ±34 грамм. Между двумя группами достоверных различий ни в весе, ни в прибавке веса животных не обнаружено.

Исследование проведено на 18 срезах гиппокампа (СГ) опытной и 14 СГ контрольной группы. Спонтанная импульсная активность пирамидных нейронов поля CAl зарегистрирована в 13 (72%) СГ опытной и в 5 (35%) СГ контрольной группы фиг. 1, А. Фокальные вызванные потенциалы (ФП) с сохраненными пре- и постсинаптическими компонентами зарегистрированы в 12 (67%) СГ опытной и в 7 (50% ) СГ контрольной группы (фиг.1,Б). Следует отметить, что ФП в срезах обеих групп содержали, как правила, 2 4 популяционных спайка (ПС) компонента фокального потенциала, отражающего синхронный разряд пирамидных нейронов. ПС в СГ опытной группы в среднем имел амплитуду 217 + 55 мкВ, в СГ контрольной группы 220 + 54 мкВ. Частотная потенциация (ЧП) и кратковременные посттетанические изменения наблюдались в срезах контрольной и опытной групп. При стимуляции частотой 1 Гц в среднем возрастание амплитуды ПС в контрольной группе произошло на 60 + 27% в опытной группе на 55 + 31% Различия недостоверны.

Существенные отличия между контрольной и опытной группами обнаружены при исследовании феномена длительной постетанической потенциации (ДП). Если амплитуда ПС после тетанизации возрастала более, чем на 25% и не снижалась в течение 30 мин, то считали, что ДП развилась.

В контрольной группе ДП удалось выработать в 3-х из 14 СГ, выделенных из мозга 2-х из 8 (25%) крыс (фиг.1, В). У одной из крыс ДП выразилась в увеличении амплитуды ПС на 45% (фиг.2, на этом рисунке и на фиг.3 и 4 черные кружки указывают амплитуду вызванного потенциала в мВ, вертикальные линии отмечают моменты подачи высокочастотной стимуляции тетанизации). У другой ДП выразилась в возрастании вероятности разряда пирамидного нейрона в 10 раз (первый срез) или в появлении регулярного вызванного ответа пирамидного нейрона после тетанизации (второй срез). В остальных случаях после тетанизации наблюдали либо депрессию ПС, либо отсутствие изменений амплитуды ПС (фиг.3). Повторная тетанизация приводила к депрессии вызванного ответа во всех срезах контрольной группы (фиг.3).

В опытной группе ДП удалось выработать в 10 из 18 СГ, выделенных из мозга 7 из 10 (70%) крыс (фиг.1,В). В среднем амплитуда ПС возрастала на 151% ±26% Повторная тетанизация во всех исследованных случаях приводила к дальнейшему возрастанию ответа. На фиг.4 показан пример дальнейшего роста потенциированного ответа: после второй тетанизации он составил 830% и после третьей 1300%
Пример 2. Модель бактериального шока.

Бактериальный шок у животных вызвали однократной внутрибрюшинной инъекцией взвеси суточной культуры различных бактерий в минимальной смертельной дозе (определялась перед проведением собственно эксперимента). В организм животных опытной группы предварительно (профилактически) вводили D₂O путем предоставления тяжелой воды в качестве питья за 2 4 суток до инфицирования. Опыты были проведены на беспородных белых мышах. На фиг.5 в графическом виде представлены результаты эксперимента с культурой пневмококка. Можно видеть, что гибель животных в опытной группе отсрочена на время около суток по сравнению с контрольной, а через 48 часов в контрольной группе погибли 100% животных а в опытной только 50% В опыте, показанном на фиг.6, животным обеих групп после наступления шока дополнительно проводили терапию, направленную на поддержание циркуляции крови, что позволило растянуть процесс гибели животных в контрольной группе. Можно видеть, что как и в предыдущем опыте гибель животных, получавших D₂O, наступает позже (в данном случае уже на двое суток), причем половина животных справилась с шоком и выжила.

Пример 3. Модель токсического шока
Схема проведения экспериментов такая же как в Примере 2. Опыты были проведены на беспородных белых крысах. На фиг.7 показаны результаты опыта с инъекцией минимальной смертельной дозы стафилококкового токсина. Как и в случае бактериального шока имеет место отсрочка гибели и выживание 40% животных, получавших предварительно тяжелую воду, причем в данном случае без применения дополнительных средств терапии.

Пример 4. Модель сепсиса.

Влияние D₂O на течение сепсиса процесса изучали на беспородных белых крысах массой 180 200 г. Септический процесс у животных вызвали по разработанной ранее методике путем однократного внутримышечного введения 0,3 мл взвеси суточной культуры стандартного штамма синегнойной палочки N 453 в 10% растворе CaCl₂. Концентрация бактерий во всех опытах была одинаковой и составляла 70•10⁹ микробных тел в 1 мл. Применение CaCl₂ приводило к образованию некротического участка в месте инъекции, что препятствовало инкапсуляции очага инфекции, давая возможность распространению инфекции и образованию во внутренних органах матастатических пиемических очагов. Развитие инфекционного процесса при этом не было столь быстротечным как в случае бактериального шока и он принимал сходство с развитием септической болезни у человека. Характерным признаком септического процесса были определяемые макро- и микроскопически метастатические пиемические очаги в почках, легких, селезенке и печени. При вскрытии погибших животных определялись дистрофические изменения внутренних органов.

Критериями воздействия D₂O на генерализованный инфекционный процесс служили летальность животных.

Как и ранее животные опытной группы получали тяжелую воду до и после инфицирования.

Результаты применения тяжелой воды показывают удлинение промежутка до начала гибели животных на 3 суток и значительное (в 3 раза) снижение смертности (фиг.8).

Таким образом результате применения тяжелой воды у 70% старых животных вырабатывалась ДП с выраженностью (относительное увеличение вызванных ответов после тетанизации) характерной для взрослых здоровых животных. Однако, едва ли не более существенным, чем количественная сторона эффекта является качественная характеристика восстановленного феномена ДП: восстановление характерной только для молодых животных реакции на повторную тетанизацию.

В соответствии с графиком проведения электрофизиологических измерений три последних крысы опытной группы, обнаружившие выраженный восстановительный феномен ДП, поступили в опыт на 19, 20 и 21 сутки после начала измерений (т. е. на 25, 26 и 27 сутки после отмены D₂O). Отсюда следует, что восстановленный феномен ДП сохранялся длительное время (почти месяц) после прекращения лечения. Иными словами, 3-х недельное потребление тяжелой воды позволило старым крысам не только полностью восстановить, но и поддерживать работу всех звеньев механизма ДП.

Присутствие тяжелой воды в организме животных, подвергшихся бактериальной инфекции способствовало поддержанию функций, что позволило замедлить гибель животных в условиях бактериального и токсического шока и давало возможность организму успешнее справляться с инфекцией в хронических экспериментах.

Использование, в области медицины, в частности, для лечения и профилактики болезней, связанных со старением. Сущность изобретения, оксид дейтерия /D₂O/ - тяжелый изотоп обычной воды применяется путем замены им части воды в организме как средство для профилактической, поддерживающей и восстановительной терапии развивающихся при старении и/или под действием патогенных факторов патологий, связанных с дистрофическими и дегенеративными изменениями органов и тканей. 8 ил.

Применение оксида дейтерия в качестве средства для профилактической, поддерживающей и восстановительной терапии развивающихся при старении и/или под воздействием патогенных факторов патологий, связанных с дистрофическими и дегенеративными изменениями органов и тканей.