Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к биотехнологии, и может быть использовано в технологическом процессе получения фимбрий. Последние могут найти применение при получении специфических антисывороток и создании на их основе диагностических препаратов.
Отечественных аналогов зарегистрировано не было. Штамм K. pneumoniae выделен из клинического материала больного диареей, депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под N 217.
Свойства штамма K. pneumoniae N 217. Морфологические признаки. Грамотрицательные короткие палочки, неподвижны, жгутиков и спор не образуют. При окраске в тушевом препарате по Бурри установлена продукция капсулы, размер которой достигает до 1/2 диаметра тела бактериальной клетки.
Электронно-микроскопические данные: палочки с закругленными концами, размер клетки, мкм: длина 1,84 ± 0,18 мкм при m95% ширина 1,02 ± 0,02 мкм при m 95% При просмотре более 2000 клеток жгутики не обнаружены.
Бактериальные клетки имеют фимбрии, процент бактериальных клеток, несущих фимбрии, составляет 92,7-99,8% при Р0,001, 96,1-99,5 при Р 0,005. Фимбрии располагаются перитрихиально от 2 до 12 на каждой клетке. Размеры фимбрий: диаметр 13-16 нм, длина 0,8-2,7 мкм.
Культуральные признаки. На мясопептонном бульоне через 3 ч при 37оС наступает легкое диффузное помутнение среды, через 16-18 ч помутнение с легкой пленкой. На плотных питательных средах через 18 ч при 37 ± 0,5оС образует колонии, которые выглядят следующим образом: на среде Эндо: колонии темно-розового цвета с более темной окраской в центре, выпуклые с легким серо-металлическим блеском, маслянистые, диаметр колоний 1,5-2 мм. Признаков диссоциации нет;
на среде К2: колонии светло-желтого цвета с более выраженной окраской в центре, куполообразные, маслянистые, с ровными краями, диаметр колоний 2,0-3,0 мм;
на мясо-пептонном агаре: колонии светло-молочного цвета, полупрозрачные, с ровными краями, маслянистые, диаметр 1,5-2,0 мм, признаков диссоциации нет.
Физиолого-биохимические признаки. Оптимум роста 37,0 ± 0,5оС, оптимум рН среды 7,0-7,2, оптимальные условия аэробные. Активно расщепляет глюкозу и глицерин с образованием кислоты и газа, а также лактозу, маннит, сахарозу, мальтозу, адонит, инозит, сорбит, ксилозу, рамнозу, декарбоксилирует лизин, утилизирует малонат натрия, цитрат Козера, обладает уреазной активностью, дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, т.е. ферментирует глюкозу с образованием ацетилметилкарбинола (ацетоина), не расщепляет дульцит, не образует сероводород и индол, в реакции метил рот отрицательна, орнитиндекарбоксилаза, аргининдегидролаза и фенилаланиндезаминаза отсутствуют, неподвижен.
Агглютинируется "К" сывороткой К-81 (при серотипировании был использован набор сывороток ВНИИВиС им. Мечникова). Чувствительность к антибиотикам. Исследованиями методом серийных разведений установлена чувствительность к следующим препаратам: канамицину (5 мкг/мл), гентамицину (2,5 мкг/мл), сизомицину (1 мкг/мл), клафорану (25 мкг/мл), цефалотину (25 мкг/мл), доксициклину (30 мкг/мл), полимиксину В (2,5 мкг/мл). Устойчив к бензилпенициллину (10 мкг/мл), ампициллину (1,5 мкг/мл), ампиоксу (1,5 мкг/мл), неомицину (5 мкг/мл), тетрациклину (5,0 мкг/мл), хлорамфениколу (5 мкг/мл), эритромицину (75 мкг/мл). Биологические свойства. Адгезивные свойства определяют по методу Брилис с соавт. (1) с формалинизированными эритроцитами человека 1 (0) Rh (+) группы крови. Штамм обладает адгезивными свойствами средней степени: индекс адгезии 4,43 при коэффициенте участия эритроцитов 85, средний показатель адгезии 3,86.
Вирулентные свойства: LD50 для белых мышей 1,0 · 109 м.т.
В реакции агглютинации на стекле, в пробирках, планшетах в макро- и микроварианте штамм K. pneumoniae N 217 не агглютинирует эритроциты человека I, II, III, IV группы крови, а также барана, кролика, белой мыши, крысы, морской свинки, золотистого хомячка и петуха.
Фимбрии штамма К. pneumoniae N 217 располагаются перитрихиально более 2 на каждой клетке, наиболее частое число 3-7. Фимбрии имеют трубчатую форму, размеры которых в диаметре составляют 13-16 нм при длине 0,8-2,7 мкм.
Фимбрии штамма K. pneumoniae N 217 условно названы КФА 11 (клебсиелла, фимбрии, продуцирующие адгезин 11).
Штамм K. pneumoniae N 217 является безжгутиковым стабильным продуцентом фимбрий КФА 11.
Штамм используют следующим образом.
П р и м е р 1. Культуру штамма K. pneumoniae N 217 засевают в чашки Петри с мясопептонным агаром или в пробирки со скошенным агаром (рН 7,0-7,2) и выращивают при 37,0 ± 0,5оС в течение 18-24 ч. Одну петлю выросшей на поверхности среды культуры осторожно переносят в каплю стерильной водопроводной воды в чашке Петри и суспендируют. Полученную взвесь наносят на предметную сетку электронного микроскопа, покрытую фармваровой пленкой, обрабатывают парами формалина, контрастируют 1,5%-ным раствором молибдата аммония и исследуют в электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении 15-18000 раз. На поверхности бактериальных клеток обнаруживают фимбрии, расположенные перитрихиально, более 2 на каждой бактериальной клетке. Процент фимбрийобразующих клеток составляет 92,7-99,8%
П р и м е р 2. Культуру штамма K. pneumoniae N 217 засевают в пробирку с 5 мл мясопептонного бульона (рН 7,0-7,2) и выращивают при 37,0 ± 0,5оС в течение 3 ч. Полученный таким способом инокулят вносят во флаконы объемом 0,5 л со 100 мл мясопептонного бульона. Флаконы помещают на шуттель-аппарат роторного типа (60 циклов в 1 мин, шаг платформы 45 мм) и культивируют при 37,0 ± 0,5оС в течение 18 ч. По окончанию культивирования культуру инактивируют азидом натрия 1: 10000. Далее препараты для электронно-микроскопических исследований получают, как описано в примере 1. Количество фимбрий на каждой бактериальной клетке, расположенных перитрихиально, от 2 до 12 на каждой бактериальной клетке. Фимбриеобразующих клеток от 94,1 до 99,5% (Р 0,005).
П р и м е р 3. В колбу объемом 5 л, содержащую 500 мл питательной среды вносят 25 мл инокулята, представляющего собой смыв суточной агаровой культуры K. pneumoniae N 217 (5 млрд м.т. на 1 мл). Колбу помещают на шуттель-аппарат роторного типа (60 циклов в 1 мин, шаг платформы 45 мм) и культивируют в течение 18 ч при 37-0,5оС. По окончании культивирования культуру инактивируют азидом натрия 1:10000. Препараты для электронно-микроскопических исследований получают, как описано в примере 1. Количество фимбрийобразующих клеток составляет 99,5% количество фимбрий на каждой клетке от 2 до 12. Для отделения фимбрий от поверхности клеток биомассу вначале осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин при 4оС, затем осадок ресуспендируют в 100 мл 0,05 М трис-HCl буфера, рН 7,2 и подвергают обработке на механическом дезинтеграторе "Virtus" при 20000 g в течение 15 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин при 4оС.
Супернатант, содержащий фимбрии, подвергают исследованию в реакциях агглютинации с антифимбриальной сывороткой K. pneumoniae КФА 11 на стекле или в планшетах для иммунологических реакций с V- или U-образным дном. С этой целью на предметное стекло наносят каплю антисыворотки и вносят каплю супернатанта, суспендируют. При положительной реакции происходит образование хлопьев и просветление жидкости.
При исследовании фимбрий КФА 11 с гомологичной сывороткой титр препарата 1:128-256.
П р и м е р 4. Изучение способности штамма K. pneumoniae N 217 стабильно продуцировать фимбрии проводят следующим образом: штамм хранят на полужидком голодном агаре под слоем вазелинового масла при 4оС и лиофильно высушенный через каждые 6 мес. подвергают исследованию, как описано в примере 1.
Стабильность продукции фимбрий штаммом K. pneumoniae N 217 приведена в таблице.
Штамм K. pneumoniae N 217 является стабильным продуцентом фимбрий КФА 11. Использование штамма в технологическом процессе производства при получении антигенных препаратов обеспечивает стабильный выход целевого продукта. Использование штамма не требует специальных питательных сред и оборудования.
Использование: медицинская микробиология, биотехнология, получение фимбрий К. pneumonial КФА - 11, моноспецифические сыворотки, диагностические препараты. Сущность изобретения: штамм Klebsiella pneumonial ГИСК N 217 стабильно продуцирует фимбрии при выращивании его на обычных питательных средах. Фимбрии получают путем выращивания штамма на плотной или жидкой питательной среде, осаждения биомассы, механической дезинтеграции и центрифугирования. Супернатант содержит фимбрии КФА - 11, дает реакцию агглютинации с антисывороткой в титре 1 : 64 - 1 : 128. 1 табл.
Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae - ГИСК N 217, используемый для получения фимбрий КФА-11.
