СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АВЕРМЕКТИНОВ Российский патент 1997 года по МПК G01N21/78 C12P1/06 

Изобретение относится к биотехнологии и касается контроля за производством и использованием авермектинов, которые применяются в животноводстве, растениеводстве и медицине для борьбы с эндо- и экзопаразитами животных, растений и человека.

Известны способы определения авермектинов, основанные на биологической активности авермектина, в частности, по его нематозной активности [1] Этот способ чрезвычайно трудоемкий, длительный и непригоден для экспресс-анализа авермектинов.

Известно также использование для определения авермектинов метода тонкослойной хроматографии [2] флуоресцентного метода [3] и метода ВЭЖХ [4] Последний является самым точным и быстрым методом, но требует дорогостоящего оборудования.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения авермектинов, основанный на цветной реакции с орциновым реактивом в органической фазе [5] Способ заключается в том, что к раствору пробы в органическом растворителе добавляют раствор орцинового реактива в н-бутаноле, смесь нагревают в течение 15 мин при 80^oC и измеряют оптическую плотность полученного окрашенного раствора при 630-640 нм. Однако этот способ имеет несколько стадий подготовки образца, требует дорогих реактивов и получаемые результаты трудно воспроизводимы.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа определения авермектинов и повышение его воспроизводимости.

Цель достигается тем, что авермектины экстрагируются из исследуемой пробы органическим растворителем, полученный экстракт разбавляют методом лимитирующих разведений и измеряют оптическую плотность полученного раствора при 244-248 нм. Выбранные длины волн соответствуют максимальному поглощению авермектинов. В методе могут быть использованы те растворители, которые, с одной стороны, хорошо экстрагируют авермектины, а, с другой, не мешают его спектрофотометрическому определению при указанных длинах волн. К таким растворителям относится, например, ацетонитрил, толуол, хлороформ, этанол, бутанол, метанол, имеющие минимальную оптическую плотность в области 240-250 нм.

Метод лимитирующих разведений заключается в том, что исходный раствор разводят сначала в n раз, затем еще раз в n раз и т.д. получая при этом ряд растворов со все уменьшающейся концентрацией.

Использование такого последовательного разведения позволяет добиться воспроизводимых результатов при измерении оптической плотности, в то время как иные способы разведения экстракта до концентраций, пригодных для УФ исследований, дают плохо воспроизводимые результаты.

Оптическая плотность измеряется, как правило, для нескольких последовательных разведений (не менее трех). Концентрация авермектинов в пробе рассчитывают по калибровочной кривой, для построения которой используют авермектин или ивермектин.

Пример. Построение калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой используют раствор ивермектина фирмы "Мерк" (ФРГ) с содержанием ивермектина 5 мг/мл. Из него готовят серию разведений в этиловом спирте до получения растворов с концентрациями от 10 до 40 мкг/см³. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 246 нм против контрольного раствора этилового спирта в кварцевой кювете с длиной грани 1 см.

Калибровочная кривая, построенная на основании четырех параллельных измерений, приведена на чертеже.

Определение концентрации авермектина в культуральной жидкости. 5 см³ культуральной жидкости Streptomyces avermytelis ВНИИСХМ 56 после 100; 140; 168 ч выращивания центрифугируют 15 мин при скорости 8000 об/мин.

Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 5 см³ дистиллированной воды и перемешивают. После выдержки раствора в течение 10 мин в холодильнике при температуре 5± 0,5^oC, осадок отделяют на центрифуге (15 мин при 8000 об/мин) Надосадочную жидкость сливают, к осадку приливают 5 см³ этилового спирта для экстракции авермектинов. Экстракцию проводят при перемешивании на магнитной мешалке в течение 20 мин. Экстракт отделяют на центрифуге (15 мин при 8000 об/мин). Осадок отбрасывают. Из полученного экстракта отбирают 1 см³, переносят в чистую пробирку и растворяют до 5 см³ этиловым спиртом (разведение 5), затем уже из вновь приготовленного раствора отбирают 1 см³, снова переносят в чистую пробирку и еще раз разводят до 5 см³ (разведение 25). Аналогично осуществляют следующие разведения, получая таким образом растворы с разбавлением 125, 625 раз.

Измерение оптической плотности полученных растворов проводят на спектрофотометре Jas. co UVIDEC-610 при длине волны 246 нм против контрольного раствора этилового спирта.

Полученные результаты для трех параллельных измерений приведены в таблице.

Расчет концентрации авермектинов. Для расчета выбирают разведение, для которого оптическая плотность попадает в интервал 0,3-1,6. По калибровочному графику определяют концентрации стандарта и среднее значение концентрации стандарта умножают на кратность разведения и на коэффициент K=0,35, рассчитанный на основании контрольных определений концентрации авермектинов параллельно заявляемым методом и методом ВЭЖХ.

Необходимость введения данного коэффициента связана с тем, что в качестве стандарта при калибровке используют раствор авермектина.

Сравнение значений концентраций авермектина, полученных заявляемым способом и способом ВЭЖХ, показывает, что предлагаемый способ позволяет определять концентрацию авермектина быстро и без применения специального оборудования и реактивов.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: способ определения авермектинов, основанный на экстракции исследуемой пробы органическим растворителем, разведении полученного экстракта методом лимитирующих разведений и измерении оптической плотности полученного раствора при длине волны 244-243 нм. 1 табл. 1 ил.

Способ определения авермектинов, включающий экстракцию авермектинов органическим растворителем и измерение оптической плотности, отличающийся тем, что экстракт разбавляют методом лимитирующих разведений и измеряют оптическую плотность полученного раствора при 244 248 нм.