Способ определения авермектинов Советский патент 1993 года по МПК G01N21/78 

Изобретение относится к биотехнологии и касается контроля за производством и применение авермектинов, которые применяются в животноводстве, растениеводстве и медицине для борьбы с эндо- и зкзопара- зитами животных, растений и человека.

Цель изобретения - ускорение и упрощение определения авермектинов за счет использования колориметрического метода определения.

На чертеже представлен калибровочный график для определения концентрации авермектинов, построенный в осях Оезо - С мкг/мл, где Резо - оптическая плотность при 630 нм, С - концентрация авермектинов в растворе, мкг/мл, 1 - ивермектин, 2-авермектин Bia.

Оптическая плотность для авермектинов в интервале концентраций 2-20 мкг/мл подчиняется закону Ламберта-Бера. Определение концентраций стандартных растворов авермектинов Bia и инвермектина по

изобретению в соответствии с ИРАС пока-, зали, что средняя относительная погреш-f ность (при п 5, критерии Стьюдента | а 0,95) составляет 5-8%. П р и м е р 1. Определение содержания , авермектинов и препарате ивермектина фирмы Мерк. Навеску ивермектина в количестве 10 мг взвешивают на торсионных весах с точностью ± 2 мг и растворяют ее в 100 мл 96% этанола. К 0,2 ± 0,01 мл раствора добавляют 2,8. ± 0,1 мл н-бутанола и 2,0 ± 0,1 мл орцинового реактива (90 мл 0,1 % раствора гексагидрата хлорного желе- ; за в концентрированной соляной кислоте и 10мл 5% раствора.орцина в этаноле). Пробы тщательно перемешивают и помещают в водяную баню при 80 ± 1 °С на 15 ±1 мин, охлаждают, после чего колориметрируют . при 630 нм против холостой пробы. Содержание авермектинов находят согласно измеренной оптической плотности по калибровочному графику в мкг/мл. Для поСО

с

00

о

Os

со

(Л

00

троения калибровочного графика испольовали ивермектин фирмы Мерк или авер- ектин Bia в концентрации 2-20 мкг/мл.

Содержание авермектинов составляет ,98 мкг/мл, следовательно, исходная навека имеет вес 9,8 мг. По прототипу исходная навеска составляет 9,6 мг.

П р и м е р 2. Определение содержания авермектинов в препарате ивермектина фирмы Мерк. Все процедуры проводят ак, как это описано в примере 1, за исключением того, что пробы помещают в водяную баню при 75 ± 1°С на 20 ± 1 мин. Содержание авермектинов составляет 0,94 мкг/мл. Следовательно, исходная навеска имеет вес 9,4 мг, а по прототипу 9,6 мг,

П р и м е р 3. Определение содержания авермектинов в препаратах ивермектина фирмы Мерк. Все процедуры проводят так, как это описано в примере 1, за исключением того, что пробы помещают в водяную баню при 85 ± 1°С на 10 ± 1 мин. Содержание авермектинов составляет 0,98 мкг/мл; что соответствует исходной навеске в 9,8 мг, по прототипу 9,6 мг.

П р и м е р 4. Определение содержания авермектинов в препаратах ивермектина фирмы Мерк. Навеску ивермектина.в количестве 10 мг взвешивают с точностью ± 2 мг и растворяют ее в 100 мл метанола. Остальные операции осуществляют так, как описано в примере 1. Содержание авермектинов составляет.0,96 мкг/мл. Следовательно, исходная навеска имеет вес 9,6 мг. С помощью известного способа определено 9,6мг.П р и м е р 5. Определение содержания авермектинов в препаратах ивермектина фирмы Мерк. Навеску ивермектина в количестве 100 мг взвешивают на торсионных весах с погрешностью ± 20 мг и раство- ряют ее в 100 мл ацетона. С помощью бута- нола 1 мл полученного раствора разводят в 10 раз. К0.2 ± 0,01 мл разведенного раствора добавляют 2,8 ± 0,1 мл орцинового реактива (90 мл 0,1% раствора гексагидрата хлорного железа в концентрированной соляной кислоте и 10 мл 5% раствора, орцина в этаноле). Пробы тщательно перемешивают и помещают в водяную баню при 80 ± 1°С на 15. ± 1 мин, после чего пробы колориметрируют при 630 нм против холостой пробы. Содержание авермектинов находят согласно измеренной оптической плотности по калибровочному графику в мкг/мл, который строят с помощью ивермектина фирмы Мерк в концентрации 2- 20 мкг/мл. Содержание авермектинов составляет 0,94 мкг/мл. Следовательно, исходная навеска имеет вес 94 мг, по прототипу содержание ивермектина в исходной навеске составляет 96 мг.

П р и м е р 6. Определение содержания

авермектинов в препаратах ивермектина фирмы Мерк. Все процедуры проводят так, как это описано в примере 1, за исключением того, что пробы фотоколориметриру- ют при 640 нм против холостой пробы.

Содержание авермектинов составляет 0,93 мкг/мл, т.е. в исходной навеске содержание авермектинов составляет 9,3 мг, по прототипу вес исходной навески равен 9,6 мг. Пример. Определение содержания

авермектинов в препаратах ивермектина фирмы Мерк. Навеску ивермектина в количестве 10 мг взвешивают на торсионных весах с точностью ±2 мг и растворяют в 100 мл хлороформа. В дальнейшем поступают

так, как это описано в примере 1. Содержание авермектинов составляет 0,93 мкг/мл. Следовательно, исходный вес навески составляет 9,3 мг против 9,6 мг по прототипу. Пример 8. Определение содержания

авермектина в хроматографически очищенном препарате авермектинов .серии В. из культуральной жидкости S. avermitilts ВКМ 1301. На веску масл я н истой субста нции в количестве 100 мг взвешивают на торсионных

весах с точностью ± 20 мг. После количественного перенесения навески в мерную колбу на 100 .мл масло растворяют в 98% этаноле. Далее ход анализа аналогичен тому, как это описано в примере 1. Содержание авермектинов в хроматографически очищенном препарате авермектинов серии В из культуральной жидкости S. avermitiUs ВКМ АС 1301 составляет 0,85 мкг/мл. Следовательно, в исходной навеске маслянистого препарата авермектинов серии В содержание авермектинов составляет 85 мг, по прототипу определяется 80 мг авермектинов в препарате авермектинов серии В. Приме р 9. Определение суммарного

содержания авермектинов в культуральной жидкости Streptomyces averrnltllls ВКМ AC 1301. Культуральную жидкость Streptomyces avermitiUs ВКМ АС 1301 в возрасте 168 часов в количестве 10 мл центрифугируют при 3000

оборотах в минуту в течение 20 мин. Надоса- дочную жидкость сливают. К осадку добавляют 10 мл дистиллированной воды, охлажденной до температуры 4°С, Осадок суспендируют и выдерживают при температуре 4°С в течение 5 мин. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а к промытому осадку добавляют 10 мл 96% этанола. Осадок суспендируют и выдерживают при комнатной температуре в течение 0 мин при постоянном перемешивании. робы центрифугируют при 3000 об/мин в ечение 10 мин. К 0,2 ± 0,01 мл экстракта авермектинов добавляют 2,8 ± 0,1 мл н- бутанола и 2,0 ± 0,1 мл ;орцинового реактива. Далее поступают так, как описано в примере 1. В мицелии S.avermltllls В КМ АС 1301 определено 60 мкг/мл авермектинов, по прототипу продуктивность В КМ АС 1301 составила 70 мкг/мл.

П р и м е р 10. Определение суммарного содержания авермектинов в культуральной жидкости S.avermitllls В КМ АС 1301 при первичном скрининге культуры. Культураль- ную жидкость S avermitills В КМ АС 1301 в возрасте 168 часов в количестве 10 мл от 100 моноизолятов (100 образцов) центрифугируют при 3000 об/мин. Остальные процеду- ры выполняют так, как описано в примере 1. Средняя продуктивность по предлагаемому методу составила 68 ± 8 мкг/мл против 75 ± 5 мкг/мл по прототипу. Следовательно, время анализа 100 образцов по предлагаемому способу занимает 170 мин, в то время как анализ 100 образцов по способу прототипу 3075 мин. Иначе говоря, время анализа сокращается в 30 раз.

Было установлено, что проведение цветной реакции при температуре выше 85 ± 1°С, а также менее 15 и более 20 мин

нецелесообразно, так как это влияет на точность результатов. В первом случае из-за резкого испарения органических растворителей, а во втором - в силу недоразвития

окрашивания, если нагревание осуществляется менее 15 мин или в силу того, что интенсивность окрашивания уменьшается после достижения максимума, когда нагревание длится более 20 мин, Использование

температуры 75 ± 1°С приводит к увеличению времени проведения цветной реакции. Фотоколориметрирование образцов при длине волны ниже 630 и выше 640 нм также нецелесообразно, так как максимум

поглощения света цветным комплексом наступает при указанных длинах волн.

Формула изобретения

Способ определения авермектинов, включающий растворение анализируемой пробы в органическом растворителе и измерение оптической плотности, отличаю- щи и с я тем,.что, с целью упрощения и

ускорения, к раствору пробы в органическом растворителе добавляют раствор ор- цинового реактива в н-бутаноле, нагревают в течение 15 ± 5 мин при 80 ± 5°С и измеряют оптическую плотность полученного окрашенного раствора при 630-640 нм.

Сущность изобретения: осуществляется с помощью цветной реакции с орциновь.и реактивом в органической фазе. Реакция между авермектинами и орциновым реактивом протекает в н-бутаноле при 75-85°С в течение 10-20 мин. Максимум поглощения цветного комплекса 630-640 нм. Результаты находят по калибровочному графику, для построения которого используют ивермек- тин или авермектин Bia. 1 ил., 1 табл.L

Сравнительные данные определения содержания авермектинов в чистых препаратах и

в авермектинсодержащих субстанциях.