КОМПЛЕКСНЫЙ ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ВЕТЕРИНАРНОГО НАЗНАЧЕНИЯ Российский патент 1997 года по МПК A61K35/74 

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению препаратов для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний.

Известно, что желудочно-кишечные заболевания животных и птицы имеют различную как вирусную или бактериальную, так и смешанную этиологию.

Зачастую желудочно-кишечные заболевания сопровождаются бактериальной или вирусной инфекцией (болезнь Макера, Гамборо, Ньюкаслская болезнь и др.), что существенно осложняет течение основного заболевания и вызывает массовый падеж молодняка животных и птицы. Вместе с тем применение соответствующего лечебно-профилактического препарата способно повысить уровень неспецифической защиты препарата, способного повысить уровень неспецифической защиты организма от вирусной инфекции и воспрепятствовать размножению энтеропатогенных микроорганизмов, позволило бы в сжатые сроки снизить тяжесть заболевания и ограничить возможность его распространения среди контактирующих животных.

Известно, что для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний успешно применяют так называемые пробиотические препараты бифидумбактерин, бификол, СБА активным началом которых является клетки живых бактерий - представителей нормальной микрофлоры, кишечника, например, коли-, лектор-, бифимбактерии и стрептококки. Однако эти препараты, в том числе и наиболее близкий по составу микробной компоненты к предлагаемому препарат СБА недостаточно эффективны в лечении и профилактике вирусных заболеваний, широко распространенных среди животных и птиц, особенно в хозяйствах промышленного типа.

Известны также специфические иммуннорегуляторных белки-интерфероны, которые применяют для профилактики и лечения вирусных заболеваний животных и птицы. Эти природные соединения потенциально обладают антираковым, цитостатическим и иммунномодулирующим действием, но в тоже время они недостаточно эффективны при заболеваниях желудочно-кишечного тракта животных и человека, вызываемых бактериями.

Задачей предлагаемого изобретения является создание комплексного лечебно-профилактического препарата, обладающего антибактериальным и противовирусным действием, дополнительно повышающего уровень резистентности организма животных, а также позволяющего снизить тяжесть заболевания и ограничить возможность его сопротивления до уточнения диагноза.

Поставленная задача решается тем, что комплексный пробиотический препарат ветеринарного назначения, содержащий клетки бактерий, являющихся представителями нормофлормы кишечника животных и птиц, биостабилизаторы и наполнитель дополнительно содержит компонент с биологической активностью интерферонов, причем в качестве этого компонента используется рекомбинантный интерферон альфа, либо рекомбинантный интерферон гамма, либо их смесь, при следующем соотношении компонентов:
жизнеспособные клетки бифидумбактерий и стрептококков в количестве 100 - 500 млн. каждого вида;
интерферон альфа (0,5 5) • 10^-6 мг
интерферон гамма (5 50) • 10^-6 мг
лактоза 200 250 мг
полиглюкин 75 90 мг
сахароза 200 250 мг
окись алюминия 250 350 мг
Препарату присвоено название "Бактоферон".

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуры БФ 4 и ВГНКИ 27 выращивают на жидких питательных средах и высушивают в сублимационных установках. Полученные таким образом сухие биомассы содержат 1000 млрд. жизнеспособных микробных клеток в одном грамме. Далее сухие культуры измельчают, смешивают между собой в равной пропорции и закладывают на хранение до приготовления конечной формы комплексного препарата.

Культуры клеток штамма 20050 или НВ 101, трансформированные соответственно плазмидными ДНК p (I альфа) и p (I гамма), выращивают на жидких питательных средах, содержащих кислотный гидролизат казеина или пекарских дрожжей до оптической концентрации 4-6 единиц, при длине волны 540 нм. Культуры концентрируют, отмывают от продуктов метаболизма и суспендируют в буферном растворе (50 мМ Трис-HCI, pH 8,0; 5 сахароза) из расчета 10 мл на 1 г клеточной суспензии. Для лизиса клеточной стенки в среду добавляют лизоцим до концентрации, равной 0,15 мг/мл, и инкубируют ее в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего замораживают до температуры -25^oC. После проведения двухкратного цикла замораживания-оттаивания в суспензию добавляют раствор ДНК-азы (0,01 мг/мл) и моли магния до концентрации 10 мМ, инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре и центрифугируют при 5000 в течение 10 мин для удаления осадка субклеточных компонентов. Полученные светлые лизаты смешивают с забуфернным раствором сахарозы до конечной концентрации последней 50 мг/мл, и высушивают сублимационным способом со средой высушивания состава: 40 лактозы и 6 полиглюкина.

Антивирусную активность интерферонов (МЕ/доза) определяет методом ингибирования цитопатического эффекта вируса везикулярного стоматита на культуре диплоидных фибробластов человека, а их концентрацию методом иммунноферментного анализа.

Комплексный препарат готовят, исходя из исходной биологической активности интерферонов, путем смешивания порошка на их основе со смесью бифидумбактерий и стрептококков (по 100 миллионов микробных клеток каждого вида). Дополнительно в состав препарата вводят окись алюминия 25 от массы сухого материала, что необходимо для обеспечения стабильности физико-химических свойств препарата.

Приготовленный препарат имеет следующий состав (в 1 г сухого веса) жизнеспособные клетки бифидумбактерий и стептококка 100 миллионов каждого вида; интерферон альфа 0,5•10^-6 мг, интерферон гамма - 5•10^-6 мг, лактоза 200 мг, полиглюкин 75 мг, сахароза 200 мг, окись алюминия 250 мг.

Препарат добавляют в сухие и жидкие корма в соответствии с рекомендациями для лечебного или профилактического применения.

Пример 2. Определяется изменение биологической активности в работе на одну условную дозу бактериального компонента и сохранность активирусного компонента после приготовления препарата "Бактоферон" следующего состава (на 1 г сухого веса): жизнеспособные клетки бифидумбактерий и стрептококка в количестве по 140 миллионов каждого вида, интерферон альфа 1,56•10^-6 мг, интерферон гамма 15,6•10^-6 мг, лактоза - 200 мг, полиглюкин 75 мг, сахароза 200 мг, окись алюминия 250 мг через 3 месяца хранения его при положительной температуре (25±2)^oC.

Навеска препарата разводится в физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде из расчета: одна условная доза бактериального компонента в 1 мл анализируемой взвеси. Одна часть материала исследуется на содержание клеток бифидумбактерий и стрептококков методом последовательных серийных разведений и высева на питательные среды. Определяется также активность кислотообразования и антагонистическая активность препарата методом совместного культивирования с тест-штаммами энтеропатогенных эшерихий.

Другая часть материала используется для определения биологической активности интерферонов. Данные этих исследований представлены в табл. 1.

Из представленных в табл. 1 результатов следует, что все биологически активные компоненты препарата "Бактоферон", входящие в состав комплекса, сохраняют свои и свойства при хранении в течение трех месяцев на удовлетворительном уровне. Антагонистическая активность, определенная по величине зоны задержки роста тестовых микроорганизмов ( E. coli 1075/0149 K91 K88, E. coli 722/0141 K87 K88, E. coli 292/0149 K91 K88, E. coli 117/0149 K91 K88, Salm. diblin, Salm. tifimurium), сохранилась на уровне, соответствующем исходным штаммам.

Пример 3. Оценивается профилактическая эффективность препарата, содержащего в 1 г сухого веса:
жизнеспособные клетки бифидумбактерий и стептококков в количестве 100 млн. каждого вида;
интерферон альфа 0,5 • 10^-6 мг
интерферон гамма 5 • 10^-6
лактоза 220 мг
полиглюкин 80 мг
сахароза 200 мг
окись алюминия 300 мг
в опыте на молодняке птицы яичного направления в хозяйстве промышленного типа, стационарно неблагополучном по болезни Макера. Отход птицы по болезни Марека на фоне специфической вакцинации составляет до 10 от всего поголовья, падеж от желудочно-кишечных заболеваний составляет 24 26 от общего количества падежа с высевом от павшей птицы энтеропатогенных эшерихий.

В качестве опытной используют группу цыплят, начиная с однодевного возраста, в количестве 56 000 голов.

В качестве контрольной используют две группы цыплят, начиная с однодневного возраста, в количестве по 35 000 голов каждая. Посадка опытной и одной контрольной группы осуществляется одновременно. Посадка второй опытной группы осуществляется на следующие сутки. Посадка цыплят опытной и каждой из контрольных групп производится в отдельные корпуса.

Сразу после размещения цыплят группы проводят обработку помещения регидратированным препаратом "Бактоферон", проведя расчет по формуле, принятой для аэрозольной вакцинации птицы, из расчета по 50 МЕ альфа и гамма интерферонов (0,25 • 10^-6 мг и 2,5 • 10^-6 мг, соответственно) и по 100 миллионов живых стрептококков и бифидобактерий на головку.

Цыплятам опытной группы препарат "Бактоферон" продолжает давать с кормом на протяжении 10 дней, начиная со второго дня посадки, в общем количестве не менее 1 дозы на головку (доза содержит по 100 миллионов жизнеспособных клеток бифидумбактерий и стрептококков, по 50 МЕ альфа и гамма интерферонов).

Цыплят контрольных групп обрабатывает по схеме профилактики, принятой в хозяйстве.

Результаты опыта представлены в табл. 2.

Из представленных в табл. 2 результатов следует, что препарат "Бактоферон" оказывает положительное действие при применении на птице. Падеж птицы в опытной группе сократился в 2,5-4 раза по сравнению с контрольными.

Пример 4. Используется препарат "Бактоферон", приготовленный в виде драже, следующего состава (на 1 г сухого веса)
жизнеспособные клетки бифидумбактерий и стрептококка в количестве 500 миллионов каждого вида;
интерферон альфа 5 • 10^-6 мг
интерферон гамма 50 • 10^-6 мг
лактоза 250 мг
полиглюкин 90 мг
сахароза 250 мг
окись алюминия 350 мг
Терапевтическая эффективность препарата оценивается на собаках с симптомами острого желудочно-кишечного заболевания невыясненной этиологии.

Черный английский дог, сука, возраст 5 мес. вес около 20 кг.

Клинические признаки заболевания проявились в течение двух суток и выражались в отказе от пищи, рвоте, диарее с примесью крови в кале. На третьи сутки после возникновения первых клинических признаков заболевания собаке дали 3 драже (5-6 доз) препарата "Бактоферон", предварительно растворив его в питьевой воде. В течение последующих 4-х часов дали препарат повторно два раза по 3 драже на прием. Через 6 часов после первой дачи препарата произошло стойкое улучшение клинического состояния с нормализация функции желудочно-кишечного тракта, прекращением диареи и рвоты. На следующие сутки собака стала принимать пищу и вышла на прогулку. Рецидива заболевания не отмечено.

Собака породы "Колли", сука, возраст 2,5 года. В течение недели наблюдается рвота и понос. Начато лечение с предъявления 3 драже препарата по два раза в день. На третьи сутки от начала лечения отмечено улучшения животного и исчезновение клинических признаков диареи.

Препарат продолжали давать еще в течение трех последующих суток. Повторных рецидивов по окончании курса лечения не наблюдалось, наступило полное выздоровление.

Собака породы "Кокер-спаниель", 4 мес. кобель. В анамнезе отмечено следующее: у собаки в течение трех дней наблюдались диарея и рвота. С момента выявления заболевания была назначена терапия антибиотиками в виде внутримышечных инъекций. На вторые сутки после начала лечения состояние животного улучшилось, что послужило основанием для прекращения антибиототерапии.

В последующие сутки состояние собаки снова резко ухудшилось и повторное применение антибиотиков должного эффекта не дало.

Препарат "Бактоферон" начали давать по одной таблетки три раза в день. Улучшение наступило на 2 сутки, курс лечения продолжали в течение последующих 7 суток по указанной схеме без применения антибиотикотерапии. Лечение завершилось полным выздоровлением, рецидива не отмечено в отдаленные сроки наблюдения.

Таким образом, разработан новый лечебно-профилактический препарат "Бактоферон", содержащий в качестве активных начал пробиотический и интивирусные компоненты, обладающий терапевтической эффективностью в случаях бактериальной, вирусной и смешанной желудочно-кишечной инфекции животных и птицы.

Препарат может применяться в виде твердых или сыпучих лекарственных форм и использоваться путем включения в состав сухих и жидких кормов, массовых аэрозольных обработках сельскохозяйственных животных и птицы, индивидуальном лечении и профилактике заболеваний в малых фермерских хозяйствах и звероводческих комплексах.

Предложен новый комплексный пробиотический препарат, содержащий в качестве активных начал клетки бактерий, являющихся представителями нормофлоры кишечника животных и птиц и компонентов с биологической активностью интерферонов, причем в качестве этого компонента используется рекомбинантный интерферон альфа, либо рекомбинантный интерферон гамма, либо их смесь. В состав препарата входят также биостабилизаторы и наполнитель. Препарат может применяться в виде твердых или сыпучих лекарственных форм и использоваться путем включения в состав сухих или жидких кормов, массовых аэрозольных обработках сельскохозяйственных животных и птицы, индивидуальном лечении и профилактике заболеваний в малых фермерских хозяйствах и звероводческих комплексах. 2 табл.

Комплексный пробиотический препарат ветеринарного назначения, содержащий клетки бактерий, являющихся представителями нормофлоры кишечника, биостабилизаторы и наполнитель, отличающийся тем, что он дополнительно содержит компонент с биологической активностью интерферонов, причем в качестве компонента с биологической активностью используется смесь рекомбинантных интерферонов альфа и гамма при следующем соотношении компонентов, мг:
Жизнеспособные клетки бифидумбактерий и стрептококков, млн. каждого вида
100 500
Интерферон альфа (0,5 5,0) • 10^- 6
Интерферон гамма (5 50) • 10^- 6
Лактоза 200 250
Полиглюкин 75 90
Сахароза 200 250
Окись алюминия 250 350у