СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ - ПРОДУЦЕНТОВ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА B(HBsAG) Российский патент 1997 года по МПК C12N1/16 C12N15/51 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано при получении рекомбинантных штаммов продуцентов HB_s-антигена (HB_sAg) вируса гепатита B.

Известен способ получения рекомбинантного штамма дрожжей продуцента HB_sAg вируса гепатита B путем скрещивания родительских гаплоидных штаммов дрожжей с последующей трансформацией диплоидных клеток плазмидой и скринингом под контролем HB_s-активности клонов (см. например: G.M.Lee, K.B.Soug, S.K.Rhee, M.H.Han "Plasmid maintenance and growth of recombihant Saccharomyces cerevisiae producing hepatitis B virus surface antigen", Biotechnology Letters, 1986, V.8,6,385-390; A.Miganohara at al. "Expression of hepatitis B surface antigen gene in yeast" Pros. Nat.Aca.Sci.USA,1983,V.80,1-5; 1.-Y. Min, H. -F. Kung et al. "Controlled Fed-Bateh Fermentation of Recombinant Saccharomyces cerevisiae to Produce Hepatitis B Surface Antigen". Biotechnology and Bioengineering, 1988, V.32, pp.334 340.

Недостаток известного способа заключается в исключительной трудоемкости приема определения HB_s-активности при выполнении операции скрининга клонов. Общеизвестно, что определение HB_s-активности при скрининге осуществляют путем накопления биомассы каждого контролируемого клона в течение 1 суток в полной органической среде (например, среде YEPD) с последующим отделением клеток, выращиванием их в селективной среде для синтеза HB_s-антигена в течение 2-х суток, концентрированием клеток, их дезинтегрированием и учетом количества антигена с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) или в иммуноферментном анализе (Грановский Н.Н. Жданов В.М. Смирнов М.Н. Экспрессия гена HB_sAg вируса гепатита B под контролем промоторной области гена PH05 в клетках дрожжей. "Вопросы вирусологии", 1985, N 5, с. 558 561; Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против гепатита B рекомбинантной, дрожжевой, адсорбированной, жидкой, утв. 25.06.86 директором Института вирусологии АМН СССР).

Предлагаемое изобретение упрощает этот способ тем, что после скрещивания родительских гаплоидных штаммов дрожжей, трансформации полученных диплоидных клеток плазмидой, содержащей ген HB_sAg, проводят скрининг трансформаторов, определяя активность бета-лактамазы, и отбирают клоны с максимальной бета-лактамазной активностью, которые тестируют на образование HB_sAg и используют в качестве штаммов-продуцентов.

Такое решение задачи основано на впервые установленной нами не известной ранее закономерности максимума HB_s-активности при максимуме активности бета-лактамазы, что дает возможность при скрининге трансформеров вместо трудоемкого прямого анализа HB_s-активности использовать косвенный экспресс-анализ на бета-лактамазу, который длится не более 8 ч вместо 3-х суток.

В табл. 1 приведены результаты анализа клонов нескольких штаммов на HB_s- и бета-лактамазную активность. HB_s-активность клонов определяли в РНГА как описано выше, а бета-лактамазную активность оценивали общеизвестным методом Шевалье по времени изменения окраски агаризованной индикаторной среды на основе крахмала и йода, в которую засеяны анализируемые диплоиды.

Как видно из таблицы, высокой бета-лактамазной активности (наступлению реакции через 1 2 ч) соответствует высокий титр HB_sAg (1024-2048), а низкой бета-лактамазной активности низкий титр HB_sAg.

Для проведения контроля на бета-лактамазную активность 25 клонов достаточно одной чашки Петри с йодо-крахмальной индикаторной средой.

Пример. Гаплоидные родительские штаммы дрожжей S.cerevisiae YF135 и 5D-H3016 перекрестными штрихами засевают в чашку Петри на полную органическую среду YNB и инкубируют при 30^oC в течение 18 ч, после чего переносят на селективную для диплоидов среду YNB с добавлением 0,3 мас. лейцина и инкубируют при той же температуре и экспозиции. Полученные диплоиды трансформируют векторами pNMVG-3954 и 2-YEp-13, в составе которых имеется ген HB_sAg под промотором PH05. Трансформацию проводят обработкой диплоидных клеток 1 мл 0,2 М водного раствора хлористого лития при 30^oC в течение 2 ч с последующим добавлением 1 мл 70%-го полиэтиленгликоля-4000 и 40 мкг ДНК вектора pNMVG-3954. Смесь инкубируют при 30^oC в течение 1 ч, после чего высевают на среду YNB в чашках Петри. Через 7 дней наблюдают появление колоний.

Отдельные колонии трансформантов контролируют на активность бета-лактамазы. Для этого их переносят на индикаторную питательную среду, содержащую, мас. глюкоза 0,1; крахмал 0,2; питательная основа YNB 6,7; агар-агар 2,0; 0,1 М фосфатный буфер pH 7,1 остальное. Через 18 ч инкубирования при 30^oC образовавшиеся колонии заливают растопленной при 42^oC той же средой, дополнительно содержащей по 0,3 мас. ампициллина и йода и 1,5 мас. йодистого калия, и повторно инкубируют при 30^oC, образовавшиеся колонии заливают растопленной при 42^oC той же средой, дополнительно содержащей по 0,3 мас. ампициллина и йода и 1,5 мас. йодистого калия, и повторно инкубируют при 30^oC. Фиксируют время начала просветления индикаторной среды под действием бета-лактамазы. Результаты наблюдения приведены в табл. 2.

Для использования в качестве продуцента отбирают клоны NN 1 и 2, в которых просветление индикаторной среды под действием бета-лактамазы наблюдается через 1 ч. Остальные 7 клонов, титр бета-лактамазной активности которых составляет от 3 до 9 ч, в данном примере анализируют на содержание HB_sAg для контроля.

Титр HB_sAg устанавливают путем накопления биомассы каждого контролируемого клона в течение 1 суток в полной органической среде YEPD с последующим отделением клеток с помощью центрифугирования (10 мин при 4000 об/мин), выращиванием их в селективной среде для синтеза HB_s-антигена (состав среды, г/л: KH₂PO₄ 0,03; MgSO₄ -0,5; KCl 1; NaCl 0,1; CaCl₂ 0,1; L-asparagine 2; Д-глюкоза 20; бета-аланин 5•10^-4; биотин 2•10^-6; тиамин, рибофлавин, пиридоксин, никотиновая кислота, пантотенан кальция, парааминобензойная кислота по 2•10^-4; дистиллированная вода остальное, концентрированием клеток с помощью центрифугирования в вышеуказанном режиме, их механическим дезинтегрированием с помощью стеклянных бус и учетом количества антигена в РНГА с HB_s-антительным эритроцитарным диагностикумом. Результаты анализа приведены в табл. 2.

Как видно из таблицы, клоны, отобранные по максимальному титру бета-лактамазы, способны к наработке наибольших количеств HB_s-антигена. Их можно использовать в качестве продуцентов HB_sAg.

Использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволяет упростить технологию получения вышеназванных рекомбинантов. Упрощение достигается за счет резкого снижения числа контролей на HB_sAg, требующего сложной по составу селективной питательной среды и диагностикума (указаны в примере) и значительных затрат времени (3 суток), поскольку большинство прямых контролей заменяется быстрым (1 3 ч) контролем бета-лактамазной активности клонов при скрининге с применением простой (йодно-крахмальной) селективной среды. Другими видами положительного эффекта, производными от указанного, являются: ускорение способа, снижение его материалоемкости (на среды и оборудование), трудоемкости и энергоемкости.

Использование: медицинская биотехнология, наработка поверхностного антигена вируса гепатита B /HB_sAg/ для целей диагностики и терапии. Сущность: получение рекомбинантных штаммов дрожжей, продуцирующих HB_sAg. При этом скрининг трансформированных диплоидных клеток дрожжей осуществляют по уровню β-лактамазной активности. Предложенный способ позволяет значительно упростить технологию получения рекомбинантных штаммов рассматриваемого назначения. 2 табл.

Способ получения рекомбинантных штаммов дрожжей продуцентов поверхностного антигена вируса гепатита B(HBsAg), предусматривающий скрещивание родительских гаплоидных штаммов дрожжей с последующей трансформацией диплоидных клеток плазмидой, содержащей ген HBsAg, и скринингом полученных клонов, отличающийся тем, что скрининг осуществляют путем определения активности бета-лактамазы, отбирают клоны с максимальной бета-лактамазной активностью, которые тестируют на образование HBsAg и используют в качестве штаммов-продуцентов.