ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE № 965 (ГКВ) - ПРОДУЦЕНТ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА B Российский патент 2002 года по МПК C12N1/19 A61K39/29 C12N1/19 C12R1/865 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для получения рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В /HBsAg/ при производстве препаратов для диагностики и профилактики гепатита В.

Известные штаммы дрожжей S. cerevisiae, используемые для получения HBsAg: YNN 27/ р2 m-S11 (J.-H. Hsieh, K.-Y. Shih, H.-F. Kung e. t., Biotech/Bioeng., V.32, pp.334-340, 1988); ДВУ 746/pSGL2 (С.З. Чеперегин, И.П. Арман, Н. Н. Грановский "Оптимизация экспрессии гена поверхностного антигена вируса гепатита В в дрожжах", Мол. генетика, микробиология, вирусология 1990, 5, с.17-20); GRF - 18 / pJ ДВ (О.Ф. Крупнова, Н.И. Сизова, А.Р. Смоляницкий "Повышение выхода рекомбинантных белков в дрожжах S. cerevisiae в результате оптимизации условий их культивирования". Прикл. биохимия и микробиология, 1995, т. 31, 1. 3, с.311-315), не могут быть использованы при промышленном культивировании в связи с низким уровнем продукции.

Прототипный штамм Д1589/ Воропаева Л.А., 1992, Автореферат дис. на соиск. степени канд. биол. наук/ используют для синтеза рекомбинантного дрожжевого HBsAg вируса гепатита В. Штамм получен в результате скрещивания гаплоидных штаммов с последующей трансформацией плазмидой pCGA7, в составе которой ген HBsAg клонирован под промотором РН05. Стандартная схема культивирования дрожжевых рекомбинантных штаммов с регуляцией экспрессии клонированного гена HBsAg со стороны системы гена РН05 (кислой фосфатазы дрожжей) включает две стадии. В начале в среде с высоким содержанием фосфора - 1 г/л - происходит только прирост биомассы, а экспрессия гена - мишени отсутствует вследствие репрессии РН05 промотора. На второй стадии культивирования после переноса клеточной массы в среду с низким содержанием неорганического фосфора - 0,03 г/л - происходит собственно синтез антигена. Стадия синтеза у прототипа имеет протяженность 24 ч, количество антигена к тому времени составляет в титрах РНГА (реакции непрямой гемагглютинации) 1/32000.

Недостатком прототипа является невысокий уровень продукции вирусного антигена.

Целью изобретения является увеличение количества HBsAg, синтезируемого клетками штамма-продуцента.

Для обеспечения указанной цели предлагается штамм, депонированный в Государственной коллекции вирусов (ГКВ) (ВНИИ вирусологии им. Ивановского) под номером 965.

Штамм имеет следующие характеристики:
РОДОСЛОВНАЯ ШТАММА: получен при скрещивании штаммов YF-135 и 5Д-П3016; клетки являются диплоидными, гетерозиготами по типу спаривания, гомозиготами по мутации leu 2-3,2-112, потребность в лейцине компенсируется маркерным геном Leu2 на плазмиде pCGA7, которой трансформированы клетки штамма.

КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ШТАММА: клетки шаровидные, на плотной поверхности агара формируют округлые колонии диаметром 1-3 мм, с ровным краем, белого цвета. Консистенция колоний пастообразная. При росте в жидкой среде образуют осадок на дне, поверхностный слой слегка мутный.

СПОСОБ И УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ ШТАММА
(Банк Рабочих Клеток Изготовителя) клетки хранят в замороженном состоянии при -70^oС и -196^oС в жидком азоте, состав среды: 1 УАРД/1 глицерин; концентрация клеток 10⁹ кл/мл. Также используют хранение лиофилизированной культуры при -17^oС (в качестве стабилизатора применяют лактозу).

КОНТАМИНАЦИЯ: Культура клеток штамма стерильна и при посевах на различные типы сред не выявлены заражения бактериями и грибами.

ПРИМЕР. Гаплоидные родительские штаммы дрожжей S. cerevisiae YF-135 и 5Д-ПЗ016 перекрестными штрихами засевают в чашку Петри на органическую среду УЕРД (по 2% глюкозы, пептона, агар-агара, 0,2% дрожжевого экстракта) и инкубируют в течение 18 ч, после чего переносят на селективную для диплоидов среду YNB ("Difco") и инкубируют при тех же условиях и экспозиции. Полученные диплоиды трансформируют вектором pCGA7, в составе которого клонирован ген HBsAg под промотором РН05, экспрессия которого происходит только в среде с низким содержанием неорганического фосфора (0,03 кг/л). Трансформацию клеток проводят обработкой диплоидных клеток 0,2 М водного раствора хлористого лития при 30^oС в течение 2 ч с последующим добавлением 70% полиэтиленгликоля -4000 и 40 мкг ДНК вектора. Смесь инкубируют при 30^oС в течение 1 ч, после чего высевают на среду YNB в чашках Петри. Появление колоний наблюдают через 7-9 дней, после чего их контролируют на уровень активности вирусного антигена. Отбирают клон с максимальным титром HBsAg в РНГА - 1/32000 и выращивают его в течение 24 ч в среде L_Pi, после чего клетки концентрируют в физиологическом растворе до 3•10⁹ кг/мл и хранят их в течение 3-х суток при температуре +4^oС. На следующем этапе 75 мкг суспензии (2,5•10⁸ жизнеспособных клеток) добавляют к круглодонным ячейкам (2 см, дно из органического стекла, стенки из нержавеющей стали) и высушивают под вакуумом в присутствии CaCl₂ до 4-8% влажности в образце. При соблюдении стерильности ячейки транспортируют на орбитальную космическую станцию "Мир" и размещают на специальной платформе в открытом космосе таким образом, что 2 ячейки подвержены экспозиции УФ-светом (экспериментальные образцы), а 2 ячейки экранированы от солнечных лучей (контрольные образцы). Время нахождения в открытом космосе биологического материала составляло 6 месяцев.

После возвращения на Землю в каждую ячейку добавляли 500 мкл органической среды УЕРД с целью реактивации культуры. Через 2 суток инкубации при 30±1^oС все количество суспензии высевали на среду УЕРД с агаром, и появившиеся на ней отдельные клоны были проанализированы по признаку "уровень синтеза HBsAg" в лабораторных условиях в 100 мл Lpi (0,5 л колбы) при перемешивании (rpm=200 об/мин). Результаты скрининга 8 клонов из экспериментальных ячеек представлены в табл.1.

Отбирают клон с уровнем продукции антигена 1/256000 и анализируют его в условиях промышленного реактора с рабочим объемом 300 л.

В условиях промышленной ферментации для получения клеточной массы штаммов-продуцентов HBsAg, экспрессирующей антиген, используют двухстадийную схему культивирования. На первом этапе происходит оживление клеток и накопление биомассы. Клетки из замороженного состояния оттаивают в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего их засевают в среду Hpi с высоким содержанием неорганического фосфора - 1 г/л, а также, г/л: MgSO₄ 0,5; KCl 1,0; NaCl 0,1; CaCl₂ 0,1; L-аспарагин 2,0; Д-глюкоза 20 г; β-аланин 5•10^-4; биотин, тиамин, рибофлавин, пиридоксин, никотиновая кислота, пантотенат кальция, парааминобензойная кислота - по 2•10^-4, дистиллированная вода - остальное. Начальная концентрация клеток составляет 1-5•10^-6 кл/мл и выращивание происходит в течение 18-20 ч при температуре 30^oС в водяном шейкере "Elpan". После конценгрирования клеток путем центрифугирования и однократной отмывки физиологическим раствором суспензию засевают в среду Lpi, в которой снижена концентрация неорганического фосфора до 0,03 г/л, вследствие чего происходит дерспрессия РН05 промотора и начинается синтез антигена в клетках. Каждые 2 ч роста отбирают аликвоты клеток для подсчета их концентрации и определения активности антигена. Как видно из табл. 2, штаммы имеют практически одинаковые параметры прироста биомассы, а именно, время удвоения составляет 1,5 ч и удельная скорость роста имеет значение μ=0,15 ч; выход на стационарную фазу роста происходит через 18-20 ч при максимальном урожае клеток 1,5•10^-8 кл/мл. Между штаммами существует большое отличие в динамике и уровне синтеза антигена. Так, к 12 ч роста в клетках штамма 965 активность синтезируемого антигена в РНГА находится на уровне 1/16000, тогда как прототип имеет только 1/512-1/1000. К 24 ч культивирования (конец ферментации) количество антигена в популяции составляет - 1/256000, тогда как максимальные показатели РНГА для прототипа - 1/32000. Увеличение уровня продукции НBsAg в исследуемом штамме по сравнению с прототипом происходит почти на порядок, что в условиях производства антигена позволяет сократить число ферментаций и таким образом снизить материалоемкость (среды и оборудования), трудоемкость и энергоемкость технологического процесса.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В (НBsAg). Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae 965 (ГКВ) обладает высоким уровнем продукции поверхностного антигена вируса гепатита В с активностью к концу ферментации 1/256000, что превышает в 10 раз активность HBsAg, производимого уже известными штаммами. 2 табл.

Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae 965 (ГКВ) - продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В.