Изобретение относится к микробиологической промьшленности и касается получения антибиотика.
Целью изобретения является разра ботка способа получения нового поли пептидного антибиотика, обладающего противоопухолевой активностью, .
Целью йзЬбретенй я акжё являёт ся изыскание штамма, способного продуцировать этот -антибиотик.
Штамм Actinomadura sp. Н710-49 выделен из почвенного образца, Депонирован в Американской коллекции ти повых культур под номером АТСС 39144 и характеризуется следующими признаками.
Культурапьно-морфологические признаки.
Штамм образует как субстратный, так и воздушньй мицелий. Субстратный мицелий длинный и разветвленньй и не фрагментируется на короткие цепочки нити. Короткие споровые цепочки зарождаются на верхзтпке или монопо- диальном ответвлении воздушного мицелия. Споровые цепочки содержат 2-15 спор на цепь (4-8 cnopj и могут быть прямыми или иметь форму крючка или петли. Споры бородавчатую ntDBepXHOCTb и овальную или эллиптическую форму 0,5-0,6 ;х 0,1- .1,2 мкм) с круглым или заостренным концом. Зрелые споры часто отделяются друг от друга полыми гифами. Иногда наблюдаются терминальные наплывы г ифы на субстратном мицелии, помещенном на агар Чапека и агар Бен- нета.
Триптон-дрожжевой экстракт-бульон.
Рост хлопьевиднооиущенньй, седи- ментированный и не пигментированный.
Агар Чапека..Рост скудньш. Окраска от бесцветного до бледооранжево- го (73)Цветной стандарт из книги К.Л.Келли и Д.Б.Джудд. ISCC-NBC color-name charts illustrated with centroid colo irs . Dept of Comm. cire 553, Вашингтон, D.C., 1975 г. Воздушный мицели й скудньй, белый (263}, пигмент отсутствует.
Глюкозоаспарагиновый агар. Рост плохой. Окраска от желтовато-желтого (92) до темного оранжевого-желтоватого (69). Воздушный мицелий очен скудный, белый (263), пигмент отсутствует.
Глицерин-аспарагиновый агар. Рост от плохого до умеренного. Окраска от слабо-желтого (89) до темного оранже- вато-желтого (72) . Воздушный мицелий слаборазвитый, белый (263) до слабого желтовато-розового (31). Пигмент бриллиантово-желтый (83).
Крахмальньш агар с минеральными солями. Рост от слабого до умеренно- го. Окраска от бесцветного до.глубо- кого желтого (85), Воздушный мицелий слаборазвитый., от розовато-бел о го до слабо-желтовато-розового (31), пигмент отсутствует.
5 Тирозиновый агар. Рост умеренный. Окраска от коричневато-оранжевого до умеренного красновато-корич- невого (43). Воздушный мицелий слабо- развитьш, от белого до светло-желтого- 1} (89).. Пигмент сильный, желтый (84).
Агар с дрожжевым экстрактом и экстрактом салода. Рост умеренньш. Окраска от темно-желтого (88) до темно- коричЯеэого (59), воздушный мицелий ;; СКУД1ВДЙ белый (263) . пигмент светлый яОливково-коричневый (94).
Агар Веннета. Рост умеренный, ок- раска от се ровато-желтовато-корич- невого (180).до темного серовато-ко- 0 ричневого (62),воздушный мицелий очень скудный, белый (263), пигмент умерен- таш оливково-коричневьш (95). Физиолого-биохимические признаки.
Макс1а4альный рост на агаре Бенне- та при . Умеренный рост при 20 и . Отсутствие роста при 10 и 4Рс., Л(елатин разжижает. Крахмал гид- рюлизует. Снятое молоко пептонизи- рует, не коагзширует. Меланоиды не jjj вырабатывает. Нитраты в нитриты восстанавливает.
Умеренно устойчив к NaCl - рост при концентрации 7%, отсутствие роста при концентрации 10%. Устойчив к ,. лизоциму, рост при 0,001%. Оптимум рН 6,0, при рН 5,0 рост отсутствует.
Усваивает глицерин, (+) арабинозу, 11 -ксилозу,- П-рибозу, L-рамнозу, Ь-глюкозу, L-фруктозу, целлобиозу, трегсшозу, растворимый крахмал, D-маннит.
Не усваивает В(-)-арабинозу, L-ra- лактозу, L-маннозу, Ъ(-)-сорбозу, сахарозу, лактозу, мелиоидозу, раффинозу -Е1(+)-мелезитозу, целлюлозу, дульцит, инозит, D-сорбит, салицин.
Способ с использованием штамма АТСС 39144 иллюстрируется следующими йримера :1и.
5
Пример 1. Ферментация.
Готовят посевную среду, содержащую,. %: маннит 1, пентон 2 и дрожжевой экстракт 1; рН 7,2 (до стерилизации), 100 мл среды в 500 мл колбе Эрленмейера инокулируют культурой, инкубируют при в течение 72 ч на роторной качалке (250 об/мин). Затем 5 мл культуры переносят во вторую посевную среду (100 мл) того же состава и культивируют в тех же условиях .
5 мл посевного материала вносят в 100 мл ферментационной среды, содержащей, %; маннит 2,5; глюкоза 0, fJ-50. Колонку элюируют деионизировансоевый порошок 1, пептон 0,5, мясной экстракт 1, СаСОз 0,3 и NaCl 0,2, Помещенной 500-мл колбу Эрленмейера.
Ферментацию проводят при 28 С в роторном смесителе при скорости вращения 250 об/мин.
Антибиотическая активность достигает 300 мкг/мл через 6-7 дн.
Пример 2. Выделение,
ной водой и активный злюат лиофилизи- . Получают 120 мг белого аморфного порошка.
При исследовании методом бумаж- 20 ного электрофореза высокого напряжения (4500 В. в 0,05 М барбиталовом буфере при рН 8,6) антибиотик ВВМ-1644 мигрирует в виде кислоты, передвигающейся на 8,7 см через 1 ч
18 л культуральной жидкости, полу-25 в направлении анода.
ченной по примеру 1, центрифугируют, полученную жидкую фазу концентрируют при температуре ниже 40°С до 1/10 начального объема. Концентрат анали35
40
зируют с помощью: целлоф ановой труб- д в обычных органических раство.рителях.
Оптическое-вращение: с (а) D - -75,б в 0,25%-ном водном растворе. УФ-спектр имеет адсорбционный м ак D/
симум при 275 нм (E/i(y 8,2) и 310 нм . (/ICN плечо) в водном растворе. В 0,01 N растворе НС1 УФ-спектр - практически идентичен УФ-спектру в воде, в 0,01 N растворе NaOH 1-1меет лишь один максимум при 285 нм (. 8,9). ИК-спектр, снятый в КВг, указывает на наличие Ш-и ОН-групп (330- 2Я80 см) и амидньк групп (l650 и 1540 см) .
Дает положительные реакции на -реагент фолин-Лоури, ксантопротеин, биу- рет и нингидрин, обесцвечивает раствор перманганата калия.
Дает отрицательные реакции с ант- роном и реактивом Сакагуши.
Молекулярный вес примерно 22000. Элементный состав, %: С 46,6; Н 6,45, N 13,43; S 0,2.
Имеется 13 видов аминокислот: ала- нин, аспарагиновая кислота, глицин, полу-цистеин, глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, фенилаланин, про- лин,серин, треонин, тирозин, валин.
Антибиотик довольно устойчив в .интервале значений рН от 2 до 9. Вод-ки против водопроводной воды в холодном помещении. Диализат концентрируют до объема 1,5 л и центрифугируют (8000 g) для удаления нерастворимых веществ. Прозрачный верхний слой насыщают сульфатом аммония и выдерживают .в течение 5 ч при 5 С. Полу- ченнь1Й осадок отделяют центрифугированием, растворяют его в. 300 мл воды и обессоливают путем диализа против водопроводной воды. 700 мл диализата содержит 22 г неочищенного твердого антибиотика. Раствор антйбиотик:а пропускают через колонку с ДЕАЕ-це.ллюлозой (С1, 400 мл),
1
колонку промывают 1 л воды и проявляют 1/15 М фосфатным буфером рН 7,0, jсодержащим 0,3 .М NaCl. Активные фракции объединяют (ЗОО мл), диализуют в течение 18 ч против водопроводной воды и хроматографируют на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой (.400 мл) , которую уравновешивают 1/14 М раствором фосфатного буфера рН 7,5. Эту колонку проявляют тем же буфером, содержащим градиентную концентрацию NaCl (0- 0,2 М). Активный элюат (17 мл) обессоливают путем диализа и загружают в колонку с ДЕАЕ-сефадексом А-50.
45
50
55
. ю19974
Колонку проявляют 1/15 М раствора буфера фосфатного, рН 7,5, coдepжaщJiM градиентную концентрацию NaCl (О - 0,3 М). Активные фракции объединяют и диализуют против воды в течение 18 ч. Обессоленный раствор (18 мл) хроматографируют на колонке с ДЕАЕ- сефадексом А50 с использованием 1/15 М раствора фосфатного буфера рН 7,0 с содержанием NaCl от О до 0,3 М в качестве элюента.
Соответствующие фракции собирают, концентрируют до объема 10 мл и обессоливают на колонке с сефадексом
ной водой и активный злюат лиофилизи- . Получают 120 мг белого аморфного порошка.
При исследовании методом бумаж- ного электрофореза высокого напряжения (4500 В. в 0,05 М барбиталовом буфере при рН 8,6) антибиотик ВВМ-1644 мигрирует в виде кислоты, передвигающейся на 8,7 см через 1 ч
Антибиотик не имеет определенной точки пла вления и постепенно разлага- ется при температуре выше 240 С. Растворим в воде, практически нерастворим
35
ный раствор устойчив в течение 2 ч при при нейтральном значении. рН. После экспонирования на УФ свете антибиотическая активность теряется за 20 мин.
Способен индуцировать профаг в лизогенных бактериях.
Проявляет антимикробную активность по отношению к грамположи- тельным и кислотоустойчивым бактериям.
Противоопухолевую активность проверяют на мышах линии BDF/( проти лимфоцитной лейкемии Р388. Каждому лшвотному инокулируют внутрибрюшин- но клеток опухоли. ОпределенРедактор Ю.Середа
Составитель Г.Смирнова
Техред И.Попович Корректор Т,Колб
Заказ 3619/60 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4
419976
ныв дозировки антибиотика вводят мышам внутрибрюшинно через 24 ч после имплантации опухоли. Применение препарата осуществляют 1 раз в день 5 на 1, 4 и 7 сут тройная доза через день) или последовательно в течение 9 дн 1 доза ежедневно) . Наибольшей активностью против лейкемии мышей обладает препарат в дозе 0,03- 10 1,0 мг/кг/день.
Антибиотик, может применяться в комбинации с инертными носителями в любой фармацевтической форме, упо- 5 требляемой для парентерального применения .
1. Способ получения антибиотика, заключающийся в том, что штамм Acti ir.t.V. nomadura sp. АТСС 39144 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в глубинных аэробных условиях с последующим отделением биомассы,выделением целевого продукта из жидкой фазы и его очисткой. 2. Штамм Actinomadura sp., АТСС 39144 (American Type Culture Collection) - продуцент антибиотика ВВМ- 1644. N9 4ib СО СО ы
