ПРЕПАРАТ С ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК A61K45/05 A61K38/19 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для повышения иммунного ответа.

Интенсивные исследования молекулярных механизмов неспецифической регуляции иммунного ответа, проводимые в последние годы, привели к обнаружению ряда белковых факторов, являющихся медиаторами иммунитета и получивших название цитокины. К числу таких факторов относится лимфотоксин (фактор некроза опухолей бета), продуцируемый активированными лимфоцитами. Лимфотоксин обладает многообразием биологических эффектов. Наряду с противоопухолевыми, противовирусными, противобактериальными свойствами лимфотоксин обладает и выраженной иммуностимулирующей активностью.

В очищенном виде лимфотоксин стабильно сохраняет свои биологические свойства лишь при хранении в условиях низких температур. При других условиях хранения биологические свойства очищенного лимфотоксина снижаются вплоть до их полной утраты. Для стабилизации биологической активности используют, как правило, бычий сывороточный альбумин, спирты, сахара и другие углеводы [1]
Известен препарат на основе лимфотоксина, в состав которого входят очищенный лимфотоксин, очищенный интерферон-гамма, хлорид натрия, бычий сывороточный альбумин [2]
Наиболее близким к предлагаемому является препарат, содержащий лимфотоксин, хлорид натрия, декстразу, глицерин, этанол [3]
Однако в состав указанных препаратов входит очищенный лимфотоксин, выделенный из лимфоидной линии клеток RPMI 1788.

Задачей изобретения является разработка отечественного препарата на основе рекомбинантного лимфотоксина человека, сохраняющего все основные биологические свойства и пригодного для парентерального применения.

Поставленная задача решается тем, что предложен препарат, содержащий очищенный рекомбинантный лимфотоксин человека, выделенный из клеток рекомбинантного штамма продуцента ВКПМ-5279, состоящий из 151 аминокислотного остатка, имеющий молекулярную массу мономера 17 кДа, цитотоксическую активность 1•10⁸ ед/мг, антивирусную активность 2•10⁶ ед/мг, а в качестве добавки дополнительно содержащий полиглюкин, ацетат натрия и хлорид натрия при следующем соотношении компонентов, мас.

Рекомбинантный лимфотоксин 0,05 0,1
Ацетат натрия 0,08 0,1
Хлорид натрия 1,5 1,8
Полиглюкин 1,3 1,5
Вода дистиллированная остальное
В качестве основного действующего начала в препарате использован рекомбинантный лимфотоксин человека, который характеризуется следующими свойствами:
Способ получения микробиологическим синтезом из клеток рекомбинантного штамма кишечной палочки
Степень чистоты в SDS-электрофорезе не менее 95%
Молекулярная масса мономера 17 кДа
Число аминокислотных остатков 151
Аминокислотный состав рекомбинантного лимфотоксина см. в конце описания.

Иммунохимические свойства взаимодействует с антителами, полученными только к лимфотоксину
Отношение к pH стабилен в диапазоне pH от 4,0 до 10,0
Цитотоксическая активность на клетках линии L 929 1•10⁸ ед/мг
Противоопухолевая активность ингибирует рост Meth A саркомы мышей
Противовирусная активность с VSV на фибробластах человека - 2•10⁶ ед/мг
Иммунорегуляторная активность стимулирует синтез агглютининов, иммуноглобулинов G,A,M, фагоцитарную активность макрофагов, NK активность
Сохраняемость биологической активности при температуре: 25^oC 2 3 дн; минус 20^oC 7 10 мес
По своим характеристикам и основным биологическим свойствам рекомбинантный лимфотоксин соответствует природному аналогу.

Препарат готовят следующим образом:
Пример 1.

В раствор очищенного рекомбинантного лимфотоксина, полученный после последней стадии очистки, вносят 0,1% ацетата натрия и 1,5% хлорида натрия, стерилизуют фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и добавляют стерильный 15% раствор полиглюкина до конечной концентрации 1,3% Смесь перемешивают, разливают в стерильные флаконы и лиофильно высушивают.

Высушенный препарат представляет собой аморфный порошок белого цвета, хорошо растворимый в дистиллированной воде с образованием бесцветного прозрачного раствора, не содержащего видимых примесей. Полученный препарат обладает всеми основными биологическими свойствами, присущими очищенному рекомбинантному иммунитету. Сохраняемость биологических свойств препарата при этом увеличивается и составляет при температуре 25^oC более одного года.

Пример 2.

Препарат готовят аналогично примеру 1, только конечная концентрация ацетата натрия составляет 0,15% хлорида натрия 1,8% и полиглюкина 1,5%
По своим биологическим свойствам и срокам хранения препарат не отличается от препарата в примере 1.

Проверка токсичности заявляемого состава, проводимая на трех видах лабораторных животных (крысах, кроликах и обезьянах) при разных способах введения и дозах показала, что он не обладал токсичностью.

Пример 3. Использование предлагаемого препарата.

60 мышей линии CBA распределяли на три группы (по 20 мышей в каждой). Первой группе животных (контроль) вводили подкожно по 0,1 мл физ. раствора. Второй группе вводили подкожно 0,1 мл вакцинного штамма Y.pestis EV в дозе 1•10⁵ м.к./мышь. Третьей группе подкожно вводили заявляемый препарат в дозе 1 мкг/мышь с одновременным введением вакцинного штамма в той же дозировке, что и во второй группе. Через 21 день после вакцинации определяли напряженность иммунитета у вакцинированных мышей путем определения величины LD₅₀ для вирулентного штамма Y.pestis 231. Результаты представлены в таблице.

Из представленных данных видно, что использование заявляемого препарата при вакцинации животных повысило степень их защищенности к заражению вирулентным штаммом Y.pestis, что выразилось в увеличении величины LD₅₀ примерно в 50 раз.

Таким образом, заявляемый препарат сохраняет все биологические свойства в течение более продолжительного времени по сравнению с очищенным рекомбинантным лимфотоксином и оказывает стимулирующее влияние на процесс вакцинации животных вакцинным штаммом Y.pestis EV.

Выявленный эффект может быть использован и при других инфекциях животных.

Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - получение отечественного препарата на основе рекомбинантного лимфотоксина человека, сохраняющего все основные биологические свойства. Предложен препарат, содержащий рекомбинантный лимфотоксин человека, ацетат натрия, хлорид натрия и поликлюкин при следующем соотношении компонентов, мас.%: рекомбинантный лимфотоксин - 0,05 - 0,1, ацетат натрия - 0,08 - 0,1, хлорид натрия - 1,5 - 1,8, поликлюкин - 1,3 - 1,5, вода дистиллированная - остальное. 1 табл.

Препарат с иммуностимулирующей активностью, содержащий рекомбинантный лимфотоксин человека, выделенный из клеток штамма продуцента ВКПМ-5279, состоящий из 151 аминокислотного остатка, имеющий молекулярную массу мономера 17 кДа, цитотоксическую активность 1 • 10⁸ ед./мг, противовирусную активность 2 • 10⁶ ед./мг, а в качестве добавки дополнительно содержит полиглюкин и ацетат натрия при следующем соотношении компонентов, мас.

Рекомбинантная лимфотоксин 0,05 0,1
Ацетат натрия 0,08 0,1
Хлорид натрия 1,5 1,8
Полиглюкин 1,3 1,5
Вода дистиллированная Остальноел