СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАГНОСОРБЕНТА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/554 

Изобретение относится к получению материалов для клинических и иммунологических исследований и может быть использовано в производстве биомагносорбентов с носителем, представляющим собой биологическую клетку.

Изобретением решается задача получения сорбентов с магнитными свойствами, пригодных для проведения иммуносорбционных исследований с высокой степенью стабильности и повышенной сорбционной способностью по отношению к биологическим препаратам.

В настоящее время для выделения и концентрирования антигенного материала, в том числе бактериальных клеток, широко применяются иммуносорбционные методы. Новым этапом усовершенствования этих методов является разработка и применение сорбентов с магнитными свойствами, применение которых позволяет проводить анализы загрязненных проб, а также ускорять исследования, требующие многократной сепарации сорбентов из жидкой фазы.

По своей структуре магнитные сорбенты могут быть простыми, состоящими лишь из магнитного порошка или гранул, на поверхности которых иммобилизован лиганд, и сложными, представляющими собой полимерную основу, в которую фиксирован магнитный материал, с последующей иммобилизацией на ней лиганда. (В. Г. Пушкарь, В.И. Ефременко и др. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов. Ж. микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, N 12, 1985 г. с. 30-34; В.И. Ефременко, В.П. Пушкарь и др. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов. Ж. микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, N 12, 1989 г. с. 100-105; Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов. Методические рекомендации. Волгоград, 1984 г.)
В этих работах представлены известные способы получения магнитных сорбентов, в том числе и с биоспецифическими свойствами.

Введение магнитного материала в полимерные гранулы осуществляют методами эмульсионной полимеризации или внедрением в пористые структуры хроматографических гелей мелких магнитных частиц ферромагнитной жидкости. При этом необходима предварительная подготовка магнитного материала, а именно получение частиц определенных размеров (0,5-3 мкм), придание частицам гидрофильных свойств путем их обработки агарозой или ацетоном с последующей фосфатизацией.

Иммобилизацию лигандов на магнитных носителях проводят либо путем адсорбции за счет гидрофобных и электростатистических взаимодействий, либо путем ковалентной связи.

Адсорбционный способ иммобилизации прост по выполнению, требует минимального количества лиганда, однако такие сорбенты имеют малую емкость и теряют специфическую активность в процессе хранения из-за непрочной связи лиганда с носителем.

Ковалентная связь обеспечивает прочное присоединение лигандов за счет наличия на поверхности сорбентов реакционно-функциональных групп. Такие группы на поверхности сорбентов получают предварительной активацией носителя при условиях, обеспечивающих сохранность функциональных групп лигандов. В основном для активации поверхности носителя используют реакции с образованием амидной связи, например, обработка глутаровым альдегидом. Однако закрепление активирующего агента на поверхности носителя недостаточно прочно, так как глутаровый альдегид гидрализуется в водной среде, что приводит к снижению стабильности сорбента в биоспецифических процессах.

После процесса иммобилизации лиганда на поверхности активированного глутаровым альдегидом носителя требуется блокирование оставшихся альдегидных групп путем обработки сорбента аминосодержащимися препаратами (лизин, глюкозамин, альбумин и др.) и промывки фосфатно-солевым буфером.

Таким образом, известные способы получения магноиммуносорбентов являются сложными и многоступенчатыми, так как требуют специальной подготовки магнитного материала, введения его в гранулы носителя, активацию поверхности носителя с целью образования на его поверхности реакционно-функциональных групп, иммобилизацию лиганда и не обеспечивают достаточной степени намагничивания частиц и прочности закрепления лиганда на поверхности сорбента.

Наиболее близким по существу к заявляемому изобретению является способ получения магнитных носителей на основе эритроцитов (Ю.Н. Данилов и др. Концентрирование магнитных носителей на основе эритроцитов в сосудистом русле. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. N 12, 1985 г. с. 701-702.)
Способ включает подготовку магнитного материала, представляющего собой стабилизированный декстрином коллоид магнетита с размерами частиц 10-40 нм, который получали осаждением из солей хлорного и хлористого железа в присутствии декстрина.

Эритроциты подвергали гипотоническому лизису в присутствии магнитного материала с последующим восстановлением целостности мембран.

Полученные таким образом магнитные эритроциты фиксировали глутаровым альдегидом, суспендировали и инкубировали в растворе сывороточного альбумина и использовали в терапии для локализации действия препарата.

В принципе, магнитные эритроциты, полученные по этому способу, могут использоваться как биомагносорбенты для проведения иммунологических исследований более эффективно, чем магноиммуносорбенты, так как имеют стандартные размеры и являются носителями биологической природы, что исключает необходимость подготовки поверхности носителя с целью образования на ней реакционно-функциональных групп для иммобилизации лиганда.

Недостатком прототипа является сложность технологии получения биомагносорбента, обусловленная необходимостью предварительной подготовки магнитного материала с определенными размерами частиц, необходимостью разрушения мембраны носителя методом гипотонического лизиса для адсорбции магнитного материала с последующим ее восстановлением. В свою очередь разрушение мембраны приводит к изменению клеточной структуры биоматериала, следствием чего является снижение стабильности и сорбционных свойств носителя.

Целью изобретения является упрощение технологии получения биомагносорбента при сохранении его клеточной структуры за счет создания условий образования магнитных частиц в структуре носителя и исключения операций разрушения и восстановления мембраны, а также предварительной подготовки биоматериала, создание возможности целенаправленного синтеза различных биомагносорбентов в зависимости от специфики иммунологического исследования за счет использования в качестве носителя соответствующего биоматериала.

Поставленная цель достигается тем, что сублимированный биоматериал, например, эритроциты, микробные клетки чумного вакцинного штамма и др. выдерживают в течение 30-50 ч в 25-37-м растворе сульфата железа, сублимируют и выдерживают в течение 30-50 ч в 15-25-м растворе аммиака и снова сублимируют. При этом обе жидкостные обработки проводят при комнатной температуре, а соотношение носителя и обрабатывающей жидкости составляет 1:1-2.

Сущность изобретения заключается в осуществлении синтеза ферромагнетика в самом биоматериале с сохранением его клеточной структуры. Трехкратное последовательное сублимирование самого биоматериала, после выдерживания его в железосодержащих растворах и окончательное сублимирование после обработки аммиаком и образования в структуре биоматериала оксидов железа обеспечивают сохранение его клеточной структуры и сорбционных свойств.

Выдерживание сублимированного материала в растворе железа и растворе аммиака при определенных концентрациях и времени обработки обеспечивают образование в структуре носителя оксидов железа и придание носителю магнитных свойств.

Проведение жидкостной обработки при комнатной температуре, а также соблюдение заявляемых соотношений биоматериала и обрабатывающей жидкости позволяет сохранить структуру и свойства биоматериала, а следовательно, достигнуть достаточную степень стабильности и сорбционных свойств биомагносорбента.

Обработкой гелей предлагаемым способом не реализуется, так как гели не выдерживают высоких концентраций сульфата железа, то есть образование оксидов железа требует значительного увеличения времени обработки аммиаком, кроме того, сублимирование и высушивание гелей приводит к нарушению их структуры.

Необходимость и достаточность заявляемых концентраций сульфата железа подтверждается зависимостью изменения скорости оседания содержащих оксиды эритроцитов от количества последних синтезированных в биоматериале при насыщении различными концентрациями соли железа, показанной на чертеже где по оси абсцисс представлены значения концентраций сульфата железа, а по оси ординат скорость оседания обработанных эритроцитов.

Пример 1. К 2 мл 15% х сублимированных эритроцитов добавляли 2 мл 25%- го раствора соли FeSO₄•7H₂O, который готовили на физ-растворе и экспозировали 30 ч при 20^oC. Суспензию эритроцитов сублимировали и вносили 2 мл 15% го раствора аммиака экспозировали в течение 30 ч при температуре 20^oC, затем снова сублимировали. Сухие эритроциты помещали в магнитное поле, под действием которого отмечали их перемещение по поверхности алюминиевой фольги.

Пример 2. К 1 мл сублимированных микробных клеток чумного вакционного штамма J. pestis EV плотностью 5•10¹⁰мк/мл добавляли 1 мл 30% го раствора соли FeSO₄•7H₂O, который готовили на физ-растворе и экспозировали 40 ч при 20^oC. Суспензию эритроцитов сублимировали и вносили 2,5 мл 25% раствора аммиака, экспозировали в течение 50 часов при 20^oC и снова сублимировали.

Пример 3. К 2 мл сублимированных 15-х эритроцитов добавляли 2,5 мл 37-го раствора соли FeSO₂•7H₂O, который который готовили на физрастворе и экспозировали 50 ч при 20^oC. Суспензию эритроцитов судлимировали и вносили 2,5 мг 25-го раствора аммиака, экспозировали в течение 50 ч при 20^oC и снова сублимировали. Сухие клетки помещали в магнитное поле, под действием которого отмечали их перемещение по поверхности алюминиевой фольги.

Пpимеp 3. К 2 мл сублимиpованных 15-х эpитpоцитов добавляли 2,5 мл 37-го pаствоpа соли FeSO₄•7H₂O, котоpый готовили на физpаствоpе и экспозиpовали 50 ч пpи 20^oC. Суспензию эpитpоцитов сублимиpовали и вносили 2,5 мл 25 -го pаствоpа аммиака, экспозиpовали в течение 50 ч пpи 20^oC и снова сублимиpовали. Сухие эpитpоциты помещали в магнитное поле, под действием котоpого отмечали их пеpемещение по повеpхности алюминиевой фольги.

Как показали экспериментальные исследования, уменьшение времени выдерживания биоматериала в железосодержащем и растворе аммиака менее 30 ч приводит к недостаточному количеству образовавшихся внутри клетки оксидов железа, что снижает степень намагничивания.

При увеличении времени насыщения клеток железосодержащим и раствором аммиака более 50 ч происходит окисление и разрушение биоматериала.

Снижение концентрации железосодержащего раствора ниже 25 приводит к недостаточному насыщению материала, что снижает степень намагничивания клеток.

Повышение концентрации железосодержащего раствора более 37 невозможно, так как при нормальных условиях наступает насыщение раствора.

При снижении концентрации аммиака ниже 15 происходит недостаточное образование оксидов железа в материале.

Повышение концентрации аммиака выше 25 нецелесообразно, так как в заявленных пределах происходит синтез оксидов железа в сорбенте.

При снижении соотношения носителя и обрабатывающей жидкости менее, чем 1:1 материал не полностью пропитывается раствором, увеличение содержания раствора более, чем 1:2 приводит к нарушению структуры биоматериала за счет образования оксидов на наружных мембранах.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволит организовать серийный выпуск биомагносорбентов для различных иммунологических и клинических исследований, предлагаемая технология получения значительно проще и надежнее по сравнению с известными способами.

Назначение: изобретение относится к получению материалов для клинических и иммунологических исследований и может быть использовано в производстве биомагносорбентов. Сущность : сублимированный биоматериал выдерживают в 25-37 %-м растворе сульфата железа в течение 30-50 часов, затем сублимируют и выдерживают в 15-25 %-м растворе аммиака в течение 30-50 часов и снова сублимируют. При этом обе жидкостные обработки проводят при комнатной температуре, а соотношение носителя и обрабатывающей жидкости соблюдают равным 1: 1-2. 1 ил.

Способ получения биомагносорбента, включающий введение ферромагнетика в биоматериал, отличающийся тем, что биоматериал предварительно сублимируют, введение ферромагнетика в биоматериал осуществляют путем выдерживания его в 25 37%-ном растворе сульфата железа в течение 30 50 ч с последующим сублимированием и выдерживанием его в 15 25%-ном растворе аммиака в течение 30 50 ч с окончательным сублимированием, при этом обе жидкостные обработки сублимированного материала проводят при комнатной температуре, а соотношение биоматериала и пропитывающих его растворов соблюдают 1 1 2 соответственно.