СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА Российский патент 1998 года по МПК C07K14/00 A61K35/14 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, конкретно к получению препарата фетального белка - альфа-фетопротеина (АФП).

АФП - представляет собой фетальный гликопротеид с молекулярной массой около 70 кД, который состоит из 590 аминокислотных остатков и содержит углеводный гликозидный компонент, составляющий до 4,3 % молекулы.

В эмбриогенезе АФП в большом количестве продуцируется клетками печени, желточного мешка и брюшной стенки плода.

На уровне организма АФП проявляет активность иммуномодулятора, он также играет важную роль в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток. Ряд его свойств очевидно опосредован его способностью присоединять и транспортировать через мембрану клеток, имеющий рецепторы к АФП, различные биологически активные лиганды. Пул эмбрионального АФП неоднороден, он представляет собой смесь молекул АФП с разными гликозидными остатками, причем эти молекулы АФП находятся в смеси в определенном количественном соотношении. Пул АФП при онкологических заболеваниях резко отличается от эмбрионального пула АФП по количественному составу гликозидных остатков.

Препараты АФП широко используются в медицине для диагностики аномалий развития плода и патологий беременности, а также для скрининга и дифференциальной диагностики злокачественных опухолей и некоторых других заболеваний. В последнее время препараты, содержащие АФП, были предложены в качестве ключевых препаратов для лечения ряда онкологических заболеваний и заболеваний, связанных с аутоиммунными нарушениями.

Поскольку молекулы АФП с разными гликозидными остатками обладают различным сродством к определенным лигандам, терапевтическая активность препаратов АФП, а также их ценность как диагностических стандартов должна в весьма значительной степени зависеть от источника и способа получения препарата. Поэтому задача оптимизации известных способов получения препаратов АФП является актуальной.

Известен способ получения АФП из эмбриональной ткани человека (AC N 583536, кл. A 61 K 37/02, опубл. 05.10.1979, Бюл. N 37), включающий обработку исходной ткани бутиловым спиртом, центрифугирование при 6000 об/мин в течение 30 минут, диализ водно-белковой фазы против 0.9% раствора хлористого натрия, аффинную хроматографию отдиализованной водно-белковой фазы на иммобилизованных эстрогенах с последующим элюированием АФП бутиловым спиртом или смесью бутилового спирта с буферным раствором.

Выход целевого продукта составляет 60 - 70%, а чистота - 90 - 95%.

Недостатками способа являются недостаточный выход и чистота целевого продукта, высокое содержание примесных белков (альбумина, гемоглобина), обогащение препарата фракциями пула АФП, способными связывать эстрогены и обедненные по другим фракциям, а также высокая трудоемкость способа и необходимость работы с легковоспламеняющимся резко пахнущим органическим реактивом - бутиловым спиртом.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ получения АФП (K. Hause et al. Clinica Chemica Acta, 133, 1983, 335-340), включающий следующие последовательные стадии:
1. Измельчение и гомогенизация эмбриональной ткани зародышей человека 8-12, недель, полученных при медицинских абортах;
2. Центрифугирование гомогената при 5000 об/мин, сбор супернатанта;
3. Осветление супернатанта центрифугированием при 12000 об/мин;
4. Очистка целевого продукта хроматографией на DE-целлюлозе;
5. Очистка целевого продукта хроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем Цибакрон-голубой F 36 A;
6. Очистка целевого продукта рехроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем Цибакрон-голубой F 36 A;
7. Доочистка целевого продукта хроматографией на DE-целлюлозе.

Недостатками прототипа являются длительность и трудоемкость процесса выделения АФП, значительные изменения состава пула АФП и денатурация части молекул, приводящие к низкому выходу конечного продукта (25-30%) и к снижению его качества (чистота препарата 85-90%, низкая стабильность при хранении).

Технической задачей изобретения является упрощение известного способа, повышение выхода, качества и стабильности целевого продукта.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем:
1. К исходному сырью (абортивная кровь) добавляют хлористый натрий до конечной концентрации 0,5 М и смесь осветляют центрифугированием.

2. Полученный супернатант подвергают хроматографической очистке на сорбенте с иммобилизованными поликлональными антителами к АФП, истощенными против белков сыворотки крови человека, причем элюцию АФП с иммуноаффинной колонки проводят 4 М раствором хлорида магния. В качестве сорбента преимущественно используют BrCN - сефарозу или BrCN - агарозу с содержанием 5-10 мг/мл антител к АФП.

3. Полученную фракцию АФП концентрируют ультрафильтрацией и очищают гельфильтрацией на ультрогеле AcA-44.

4. Полученный элюат подвергают дополнительной очистке на колонке с сорбентом на основе поликлональных антител против белков сыворотки крови человека и против иммуноглобулинов сыворотки крови животного, использованного для получения антител к АФП. В качестве сорбента используют Br-CN активированную сефарозу или агарозу с содержанием 5-10 мг/мл комплекса антител (против белков сыворотки крови человека и против иммуноглобулинов сыворотки крови животного).

5. Выделенный АФП доводят до необходимой концентрации, добавляют NaCl до концентрации 0,9-5,0% и полисахарид до концентрации 1,0-5,0% (10-50 мг/мл), полученный раствор стерилизуют фильтрацией, фасуют в ампулы или флаконы. Раствор стабилен при температуре +2 - 6^oC не менее 1 года. Для увеличения сроков хранения препарат может быть лиофильно высушен. Для этого к раствору АФП добавляют NaCl до концентрации 0,5-5,0%, полисахарид до концентрации 0,2-3,0% (2-30 мг/мл), полученный раствор стерилизуют фильтрацией, фасуют в ампулы и лиофильно высушивают. Лиофилизованный препарат стабилен не менее 4 лет при температуре -20^oC, не менее 3 лет при температуре +2 - 6^oC и не менее 2 лет при температуре +20^oC. В качестве полисахарида преимущественно используют полиглюкин, реополиглюкин, реомакродекс или любой другой полисахарид, разрешенный к применению в составе инъекционных препаратов. Выход целевого продукта составляет 76-80%, а чистота препарата - 95-96%.

Определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа являются:
- Перед осветлением исходного сырья центрифугированием в последнее добавляют NaCl до конечной концентрации 0,5 М, что обеспечивает лучшее отделение супернатанта от осадка при центрифугировании и снижение неспецифической сорбции на иммуносорбенте (первая аффинная хроматография).

- Хроматографическую очистку целевого продукта проводят в три стадии: стадия первой иммуноаффинной хроматографии, стадия концентрирования и гельфильтрации на ультрогеле, и стадия второй иммуноаффинной хроматографии. При этом первую иммуноаффинную хроматографию проводят на сорбенте с иммобилизованными на нем антителами к АФП, истощенными против белков сыворотки крови человека, а вторую на сорбенте с иммобилизованным комплексом антител против белков сыворотки крови человека и против иммуноглобулинов сыворотки крови животного, использованного для получения антител к АФП, что позволяет резко повысить чистоту и качество целевого продукта, так как первый сорбент обладает высокой удельной емкостью к АФП и способен взаимодействовать с полным набором антигенных детерминант эмбрионального пула АФП, а второй сорбент максимально сорбирует на себя весь спектр примесных белков, присутствующих во фракции АФП. При этом элюцию АФП с первой иммуноаффинной колонки проводят 4 М раствором хлорида магния, что позволяет снизить объем элюата, ускорить элюцию и исключить денатурацию АФП.

- Дополнительную очистку от балластных белков (белки и пигменты крови, денатурированные и деградированные молекулы и фрагменты молекул АФП, а также комплексы молекул АФП с другими белками) осуществляют на стадии концентрирования и гельфильтрации на ультрогеле AcA-44, что позволяет повысить чистоту целевого продукта и обогатить его функционально активными молекулами АФП.

- Для увеличения срока хранения препарата выделенный АФП переводят в раствор, содержащий целевые добавки, конкретно хлористый натрий и полисахарид и стерилизуют фильтрацией. Для более длительного хранения препарат лиофилизуют. Взятые в оптимальном диапазоне концентраций целевые добавки позволяют увеличить стабильность препаратов АФП как в лиофилизованном виде, так и в виде раствора, увеличивают повторную растворимость лиофилизованного препарата.

Заявляемый способ позволяет создать промышленную технологию получения препарата АФП высокой степени чистоты, пригодного для использования в лечебной практике.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Все операции проводят при 4^oC. К 10 л абортивной крови (общее количество АФП приблизительно 1,3 г) добавляют NaCl конечной концентрации 0,5 М и центрифугируют при 8000-10000 об/мин в течение 30 мин, осадок балластных белков отбрасывают, а супернатант смешивают с 1 л иммуносорбента на основе BrCN - сефарозы 4B, с иммобилизованными поликлональными антителами к АФП. Концентрация антител на сорбенте составляет 10 мг/мл. Смесь перемешивают в течение 18 часов, отстаивают 4-5 часов, супернатант сливают и наполняют данным сорбентом хроматографическую колонку. Колонку промывают 0,5 М NaCl до тех пор, пока оптическая плотность выходящего из колонки раствора не выйдет на плато. Затем АФП снимают, пропуская через колонку 400 мл 4 М раствора MgCl₂ с последующей промывкой колонки 10 mM NaCl.

Скорость элюции 200-250 мл/час. Объем снятой с аффинной колонки фракции АФП составляет 500-600 мл.

Полученную фракцию, содержащую АФП, концентрируют на ячейке для ультрафильтрации с мембраной YM-30 (Amicon) до объема 30-40 мл. Концентрат центрифугируют при 25000-35000 об/мин в течение 10 мин.

Для того, чтобы очистить выделенный АФП от возможных следов количеств балластных белков, супернатант, полученный после концентрирования, наносят на гельхроматографическую колонку с ультрогелем AcA-44, уравновешенную 10 mM раствором NaCl со скоростью 150-200 мл/час, собирая первый пик белка по оптической плотности.

Полученный элюат объемом 300-350 мл наносят на иммуноаффинную колонку размером 5х20 см с ковалентно связанными с BrCN-активированной сефарозой поликлональными антителами против белков сыворотки крови человека и против иммуноглобулинов сыворотки крови животного, использованного для получения поликлональных антител и АФП. Концентрация антител - 10 мг/мл. Скорость нанесения составляет 200 мл/час. Элюируют АФП с той же скоростью, собирая выходящий пик белка по оптической плотности. Объем снятой с колонки фракции АФП составил 400 мл с концентрацией 2,5 мг/мл. Общее количество выделенного АФП составило 998 мг (выход продукта - 76,8%, препарат иммунохимически чистый, электрофоретическая чистота препарата - 96%).

Выделенный АФП доводят до концентрации 0,05 мг/мл, добавляют NaCl до концентрации 5 мг/мл полиглюкин до концентрации 10 мг/мл.

Полученный раствор АФП стерилизуют фильтрацией, фасуют в ампулы (или флаконы) объем 1 мл и лиофильно высушивают. Одна ампула (флакон) лиофилизированного препарата содержит 0,05 мг АФП, 5 мг NaCl, 10 мг полиглюкина.

Пример 2. Все процедуры проводят при 4^oC аналогично примеру 1, за исключением того, что полученную заявляемым способом фракцию АФП концентрируют до конечной концентрации АФП - 30 мг/мл, вносят NaCl до концентрации 50 мг/мл (5,0%), затем-реополиглюкин до концентрации 2 мг/мл (0,2%), смесь стерилизуют фильтрацией, фасуют в ампулы (объемом 1 мл) и лиофильно высушивают.

Пример 3. Все процедуры проводят при 4^oC аналогично примеру 1, за исключением того, что полученную заявляемым способом фракцию АФП концентрируют до конечной концентрации АФП - 10 мг/мл ультрафильтрацией на мембране UF 30 (Costar), вносят NaCl до концентрации 20 мг/мл (2,0%) и реомакродекс до концентрации 50 мг/мл (5,0%). Смесь стерилизуют фильтрацией, фасуют в ампулы объемом 1 мл и запаивают. Препарат хранят в темном месте при температуре 2 - 6^oC.

Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом:
- повысить выход целевого продукта с 25-30% до 76-80%;
- повысить чистоту препарата с 85-90% до 95-96%;
- повысить качество препарата АФП за счет максимального сохранения в составе препарата функционально активных молекул АФП, а также за счет увеличения сроков хранения до четырех лет в лиофильно высушенном виде и до 1 года в жидком виде, повышения стабильности и улучшения повторной растворимости лиофилизованного препарата;
- обеспечить возможность использования препарата в медицине в качестве самостоятельной лекарственной формы, а не только в качестве компонента диагностических систем;
- обеспечить возможность промышленного производства препаратов АФП для медицины.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения препарата альфа-фетопротеина (АФП). К исходному сырью добавляют хлорид натрия. После центрифугирования проводят хроматографическую оценку в три стадии: на иммуноаффинном сорбенте с иммобилизованными поликлональными антителами, ультрафильтрацией и гельфильтрацией и на иммуноаффинном сорбенте с иммобилизованными поликлональными антителами против белков сыворотки человека и против иммуноглобулина сыворотки крови животного. Препарат стерилизуют и высушивают. Способ позволяет повысить выход и чистоту препарата. 5 з.п.ф-лы.

1. Способ получения препарата альфа-фетопротеина, включающий осветление исходного сырья центрифугированием и хроматографическую очистку целевого продукта на аффинном сорбенте, отличающийся тем, что перед центрифугированием в сырье добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 0,5 М, а хроматографическую очистку проводят последовательно в три стадии, сначала на иммуноаффинном сорбенте, содержащем поликлональные антитела к альфа-фетопротеину, причем элюцию альфа-фетопротеина с сорбента осуществляют 4М раствором хлорида магния, полученную фракцию альфа-фетопротеина дополнительно очищают ультрафильтрацией и гельфильтрацией, а затем проводят хроматографическую очистку элюата на иммуноаффинном сорбенте, содержащем комплекс поликлональных антител против белков сыворотки крови человека и против иммуноглобулинов сыворотки крови животного, далее в целевой продукт вводят хлорид натрия и полисахарид, стерилизуют фильтрацией и лиофильно высушивают или хранят в виде раствора. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве аффинного сорбента используют BrCN-сефарозу или BrCN-агарозу. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что иммуноаффинная смола на стадии первой хроматографии содержит 5 - 10 мг/мл поликлональных антител к альфа-фетопротеину, истощенных против белков сыворотки крови человека, а на стадии второй иммуноаффинной хроматографии содержит 5 -10 мг/мл комплекса антител против белков сыворотки крови человека и против иммуноглобулинов сыворотки крови животного, использованного для получения антител к АФП. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полисахарида используют полисахарид типа декстрана, выбранный из группы: полиглюкин, реополиглюкин, реомакродекс. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиофильное высушивание целевого продукта осуществляют в присутствии 5 - 50 мг/мл хлорида натрия и 2 / 30 мг/мл полисахарида. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в жидкую форму препарата АФП вводят хлорид натрия в концентрации 9 - 50 мг/мл и полисахарид в концентрации 10 - 50 мг/мл.