СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬФА-ФОТОПРОТЕИНА Российский патент 1997 года по МПК A61K38/00 C12S3/14 C12S3/22 

Изобретение относится к биологической химии (преимущественно к биотехнологии) в частности к получению онкофетального белка альфа-фетопротеина, и может быть использовано в медицине для лечения опухолевых заболеваний и заболеваний с аутоиммунными нарушениями.

Онкофетальные белки, в частности альфа-фетопротеин (АФП) широко используются в медицине для изготовления различных иммунодиагностикумов, необходимых для распознавания злокачественных опухолей, а также лечения заболеваний с аутоиммунными нарушениями и опухолевых заболеваний, поэтому, задача совершенствования известных способов получения данных белков является актуальной.

Онкофетальные белки получают из эмбриональной или опухолевой ткани человека или животных.

Известен способ получения АФП из опухолевой ткани человека, включающий выделение и хроматографическую очистку целевого продукта последовательно на нескольких сорбентах [1]
Недостатком известного способа является низкое содержание целевого продукта в исходном сырье (50 100 мкг/мл), высокая трудоемкость процесса и низкий выход целевого продукта.

Известен способ получения АФП из эмбриональной ткани человека [2] включающий ее измельчение, промывку, обработку трипсином в течение 1 ч. при температуре не более 37^oC. Полученную суспензию клеток культивируют в питательной среде в течение 7-8 сут при 37^oС, а целевой продукт отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Получают прозрачную жидкость оранжево-желтого цвета, содержащую 10% онкофетального белка.

Недостатками известного способа являются низкий выход и высокое содержание примесных белков.

Известен способ получения АФП из эмбриональной ткани человека [3] включающий обработку исходной ткани бутиловым спиртом, центрифугирование при 6000 об/мин в течение 45 мин, диализ водно-белковой фазы против 0,9-ного раствора хлористого натрия, центрифугирование, инкубирование полученного супернатанта с эстрогеном в конечной концентрации 0,005% при 0 -10^oC в течение 8 ч и выделение целевого продукта из супернатанта хроматографией на сефарозе CL-4B с иммобилизованным эстрогеном. Выход целевого продукта составляет 60-70% а чистота препарата 90 -95%
Недостатками способа являются недостаточная чистота целевого продукта, наличие примеси альбумина и гемоглобина, а также высокая трудоемкость способа и необходимость работы с легковоспламеняющимся резко пахнущим органическим реактивом бутиловым спиртом.

Наиболее близким к изобретению является способ получения АФП из эмбриональной ткани зародышей человека 8 12 нед, полученной при медицинских абортах, включающей следующие стадии [4] измельчение и гомогенизация эмбриональной ткани центрифугирирование гомогената при 5000 об/мин, сбор супернатанта; осветление супернатанта центрифугированием при 12000 об/мин; очистка целевого продукта хроматографией на ДЕ-целлюлозе; очистка целевого продукта хроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем цибакрон голубой F36-A; очистка целевого продукта рехроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем цибакрон голубой F26-A; очистка целевого продукта хроматографией на ДЕ-целлюлозе.

Недостатками прототипа являются длительность способа; низкий выход целевого продукта (25 30%), недостаточная чистота препарата (85 90%), высокая трудоемкость способа и необходимость в высокоскоростных центрифугах (которых, как известно, в нашей стране в большом дефиците).

Технической задачей предлагаемого изобретения является упрощение известного способа, увеличение частоты и выхода АФП.

Задача достигается предлагаемым способом, заключающемся в следующем: берут абортивную кровь, полученную при медицинских абортах, отделяют балластные белки центрифугированием, а полученный супернатант подвергают хроматографической очистке сначала на колонке со смолой, содержащей ковалентно пришитые антитела к АФП, а затем на колонке со смолой, содержащей комплекс ковалентно пришитых антител против белков крови человека. В качестве аффинной смолы преимущественно используют Br-CN-сефарозу, активированную глутаровым альдегидом, с содержанием 10 мг/мл антител к АФП (первая хроматография) и 10 мг/мл комплекса антител против белков крови человека (вторая хроматография). Весь раствор АФП, прошедший через вторую колонку, собирают и диализуют против дистиллированной или деионизированной воды. Затем препарат стерилизуют и лиофильно высушивают. Полученный препарат АФП проверяют на чистоту иммунохимически и путем электрофореза в полиакриламидном геле. Выход целевого продукта составляет 60 72,7% Чистота препарата 95 -96%
Определяющим отличием предлагаемого способа от прототипа является то, что хроматографическую очистку целевого продукта проводят в две стадии сначала на аффинной смоле с ковалентно пришитыми к ней антителами к АФП, а затем на колонке со смолой, содержащей комплекс ковалентно пришитых антител против белков крови человека. Это позволяет резко увеличить чистоту и качество АФП, так как первый сорбент обладает повышенной афинностью к АФП, а второй максимально сорбирует на себя весь спектр примесных белков, присутствующие в растворе АФП (альбумин, гемоглобин и другие белки). Использование данных высокоспецифических сорбентов позволяет также упростить и уменьшить длительность способа за счет сокращения стадий хроматографической очистки целевого продукта с 4 до 2.

В связи с тем, что в известных патентных и научно-технических источниках сведений об аналогичном способе получения альфа-фетопротеина не обнаружено, можно сделать вывод, что предлогаемое техническое решение отвечает критериям "новизна и изобретательский уровень".

Пример 1. Все процедуры при +4^oC. 1 л абортной крови центрифугируют со скоростью 3000 об/мин в течение 30 мин, осадок балластных белков отбрасывают, а 800 мл супернатанта наносят на хроматографическую колонку объемом 50 см³ с аффинной смолой, содержащей 10 мг/мл антител к АФП, ковалентно пришитых к Br-CN-сефарозе с помощью глутарового альдегида (производства НПО "Вектор", Россия). Скорость нанесения 100 мл/ч. Далее проводят отмывание колонки от не связавшихся белков 200 мл 0,1 М фосфатным буфером (pH7,0). Элюцию АФП проводят с помощью 0.1 М раствора HCl (pH2,0), пропуская через колонку 50 мл элюента. Процесс элюции контролируют по изменению цвета раствора, вытекающего из колонки от коричневого до желтого, спектрометрически на длине волны 260 нм. Элюат, содержащий целевой продукт, нейтрализуют до pH7,0 с помощью раствора NaOH и доводят до объема 100 мл. Затем начинают доочистку целевого продукта хроматографией на аффинной смоле, содержащей 10 мг/мл сбалансированного раствора антител против белков крови человека (производства НПО "Вектор", Россия). Для этого элюат, содержащий целевой продукт после первой хроматографии, наносят на хроматографическую колонку объемом 50 см³ с вышеназванной аффинной смолой со скоростью 50 мл/час. Весь прошедший через колонку раствор (около 100 мл), содержащий АФП, очищенный от альбумина и других балластных белков, собирают в емкость. Раствор АФП из емкости заливают в диализную остановку и проводят диализ против деионизированной воды при +4^oC в течение 6 ч.

Обессоленный после диализа раствор АФП разбавляют раствором NaCl (pH7,0) до концентрации АФП 100 мг/мл, замораживают в холодильнике и хранят при - 18^oC до начала стерильной фильтрации.

После проведения стерилизующей фильтрации, раствор АФП разливают в ампулы по 1 мл, лиофильно высушивают и хранят при +4^oC. Полученный препарат АФП проверяют на чистоту иммунохимически и при электрофорезе в полиакриламидном геле. Чистота полученного препарата 96% Выход 72,7% Препарат не содержит пирогенных и токсических примесей.

Пример 2. Все процедуры ведут при +4^oC. 1 л абортной крови осветляют центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин) осадок балластных белков отбрасывают, а супернатант наносят на хроматографическую колонку объемом 50 см³ с аффинной смолой, содержащей 10 мг/мл антител к АФП. Скорость нанесения 100 мл/час. Колонку отмывают от не связавшихся белков 100 мл физиологического раствора NaCl (pH7,0), а элюцию АФП проводят с помощью 0,1 М раствора HCl (pH2,0), пропуская через колонку 50 мл элюента. Элюат собирают, нейтрализуют до pH7,0 с помощью раствора NaOH и доводят до объема 100 мл. Затем раствор АФП наносят на колонку объемом 50 см³ с аффинной смолой, содержащей 10 мг/мл антител к альбумину, со скоростью 50 мл/час. Раствор АФП собирают в емкость, затем заливают в диализную установку и проводят диализ против дистиллированной воды в течение 10 ч. Полученный раствор АФП разбавляют физраствором до концентрации АФП 100 мг/мл, стерилизуют, разливают в ампулы и лиофильно высушивают. Выход препарата 60% Чистота препарата 95%
Использование предлагаемого способа позволяет по сравнению с прототипом:
упростить способ за счет уменьшения длительности и сокращения двух стадий хроматографии и двух стадий высокоскоростного центрифугирования;
повысить чистоту и качество целевого продукта за счет высокоэффективной хроматографической очистки продукта;
обеспечить возможность использования препарата в медицине для лечения злокачественных опухолей (а не только в качестве иммунодиагностикума).

Источники информации
1. Phil Gold et all. "Physicochemical Approach to the Purification of Human Fetoprotein from the Ascites Fluid of a Hepatoma-bearning Patient. Canser Research. 1978, N 36, p. 6 -12.

2. Авторское свидетельство СССР N 403407, кл³ А 61 К 35/48 "Способ получения биостимулятора" заявл. 26.11.68. опубл. 26.10.73.

3. Авторское свидетельство СССР N 1497806, МКИ⁴ А 61 К 37/02 "Способ получения альфа-фетопротеина".

4. Klaus Huse et all "A novel purification procedure for human fetoprotein by application of immobilised Cibacron Blu F36-A as affinity ligand Clinica Chimica Acta, 133, 1983, 335-340. прототип.

Использование: медицина и биотехнология. Сущность изобретения: абортивную кровь человека центрифугируют, а полученный супернатант подвергают двустадийной хроматографической очистке: сначала на аффинной смоле, содержащей 10 мг/мл антител к альфа-фетопротеину, ковалентно пришитых к Br-CN-сефарозе, а затем на аффинной смоле, содержащей МО мг/мл сбалансированного комплекса антител против крови человека, ковалентно пришитых к Br-CN-сефарозе. Полученный раствор альфа-фетопротеина обессоливают путем диализа против воды, стерилизуют и лиофильно высушивают. 2 з. п. ф-лы.

1. Способ получения альфа-фетопротеина, включающий осветление исходного сырья центрифугированием и хроматографическую очистку целевого продукта на аффинном сорбенте, отличающийся тем, что хроматографическую очистку проводят последовательно в две стадии, сначала на сорбенте, содержащем антитела к альфа-фетопротеину, а затем на сорбенте, содержащем комплекс антител против белков крови человека. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве аффинного сорбента используют Br-CN-сефарозу, активированную глутаровым альдегидом. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что аффинная смола на первой стадии хроматографии содержит 10 мг/мл антител к альфа-фетопротеину, на второй стадии 10 мг/мл комплекса антител к белкам крови человека.