СПОСОБ ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ДРУГИХ ВИРУСОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА С СОХРАНЕНИЕМ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ Российский патент 2000 года по МПК C12N7/04 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для инактивации вирусных патогенов в препаратах плазмы крови с сохранением функциональной активности белковой части препаратов плазмы.

Известен способ инактивации вирусных патогенов постепенной, многостадийной тепловой обработкой препаратов крови (фибриноген и факторы VIII, IX) [2].

Известен способ инактивации вирусов Эбола [3] и СПИДа [4] воздействием светом, соответствующим длинам волн, равным длинам волн излучения магния и цинка, соответственно. Происходит инактивация ферментной системы вируса, что снижает репликацию вируса.

Известен способ инактивации вирусов γ-облучением [5].

Известен способ инактивации вирусов при помощи фенола. К белковому раствору добавляют фенол в концентрации менее 1 г/100 мл раствора и выдерживают примерно 24 ч [6].

Однако тепловые способы инактивации не обеспечивают полноценной инактивации таких вирусных патогенов как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), гепатит В. Гамма-облучение обладает инактивирующим воздействием на функционально активные и необходимые белковые компоненты плазменной фракции, а при использовании облучения светом возможна инактивация других белковых компонентов плазмы, в состав которых включаются ионы Mg и Zn.

Использование химических препаратов для инактивации вирусов в дальнейшем требует полнейшего удаления этих агентов, при этом могут быть инактивированы и важные белковые компоненты.

Известен способ инактивации вирусных и бактериальных патогенов в плазме и сыворотке крови обработкой ее прогреванием при +80^oC в течение 30 мин, так как большинство видов вирусов инактивируется при 56-60^oC в течение 5 - 30 мин [1, прототип].

Тепловая обработка плазмы крови не приводит к полнейшей инактивации вирусных и бактериальных патогенов в плазме крови, а также происходит инактивация важных белков плазмы крови.

Задачей изобретения является инактивация модельных вирусных патогенов в препаратах плазмы крови без нарушения функциональных свойств входящих в нее белковых молекул, в частности фракции специфических иммуноглобулинов.

Поставленная задача решается тем, что в способе инактивации ВИЧ и других вирусов в плазме крови человека путем воздействия на них физическими факторами, включающими температурную обработку, согласно изобретению в качестве физических факторов дополнительно используют повышенное гидростатическое давление до 2500 атм одновременно с температурным воздействием, причем температурное воздействие проводят путем охлаждения плазмы крови до (-15) - (-20)^oC.

Существенным признаком изобретения является:
- обработка плазмы крови повышенным гидростатическим давлением до 2500 атм и охлаждение до (-15) - (-20)^oC.

Данный способ инактивации ВИЧ и других вирусов в плазме крови человека с сохранением функциональной активности белков плазмы крови не известен из литературных источников, что свидетельствует о соответствии заявляемого изобретения критерию "новизна" и "изобретательский уровень".

Далее следует пример конкретного исполнения изобретения.

Два модельных вируса: вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и кори выращивают по обычной методике на культурах пермессивных клеток (лимфобластоидные клетки человека МТ-4 и фибробласты японских перепелов, соответственно), определяют их исходную инфекционность, после чего в стерильных условиях разливают вирусную суспензию, либо в 0,5 мл плазмы крови человека, содержащую анти-ВИЧ иммуноглобулины, либо в культуральную среду RPMI-1640 и помещают в стерильные пластиковые пробирки объемом 0,6 мл. Пластиковые пробирки помещают в камеру высокого давления, которая представляет собой цилиндр с завинчивающимися пробками и с электровводами для измерения давления, контроля температуры и термоэлементом для ее поддержания в заданном режиме. Полость камеры высокого давления заполнена силиконовым маслом, которое бесконтактно передает создаваемое в камере ручным способом давление опытному образцу.

Охлаждение образцов в камере достигается подачей через проточную систему камеры с помощью жидкого азота, который охлаждает образцы до заданной температуры (-15) - (-20)^oC.

Образцы, находящиеся в камере с вирусом, выдерживают в течение 30 мин при заданных условиях, после чего их подогревают до комнатной температуры включением термоэлемента и, постепенно, в режиме 50 атм/мин сбрасывается гидростатическое давление до атмосферного. Указанная последовательность операций необходима для предотвращения замерзания образцов, поскольку, в случае сброса давления до уровня атмосферного без предварительного повышения температуры образцов до комнатной температуры, водный раствор может подвергнуться замерзанию при отрицательной (ниже 0^oC) температуре. Учет результатов производится до и после воздействия вышеуказанных условий - по титрованию инфекционности вирусов ВИЧ-1 и кори на чувствительных к цитопатическому действию этих вирусов клетках: клетки МТ-4 и Vero, соответственно, с оценкой жизнеспособности клеток по окрашиванию 0,4% раствором трипанового синего и последующим подсчетом живых и мертвых клеток в камере Горяева по обычной методике, а также по тестированию специфических вирусных антигенов методами ELISA и РТГА, для ВИЧ-1 и вируса кори, соответственно. Специфические анти-ВИЧ иммуноглобулины в образцах с плазмой крови анализируют методом ELISA (Rapid' Elavia Anti-HIV, Diagnostics Pasteur, Франция) по обычной методике путем двухкратного раститровывания образцов до конечного разведения, за титр образца принимают то разведение, которое превышало ОП крит. Оптическая плотность определяется на спектрофотометре типа Multiskan, Labsystem (Финляндия) при длине волны 492 нм.

В таблице приведены экспериментальные данные по конкретному выполнению заявленного изобретения.

Анализ таблицы показывает преимущества предлагаемого способа по сравнению с известным: при известном способе (прогревание при 60^oC) не происходит полная инактивация тестируемых вирусов (ВИЧ-1 и вирус кори) и при этом происходит частичная инактивация функционально важных белков плазмы крови - специфических иммуноглобулинов (титр антител после обработки в вышеуказанных условиях 1: 250), с другой стороны при стерилизации радиационной обработкой (γ- облучением) одновременно с инактивацией вирусных и бактериальных патогенов идет инактивация функциональной активности сывороточных белков. При использовании данного изобретения происходит инактивация модельных вирусных патогенов в препаратах плазмы крови без нарушения функциональных свойств входящих в нее белковых молекул, в частности фракции специфических иммуноглобулинов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Земсков М.В., Соколов М.И., Земсков В.М. Основы общей микробиологии, вирусологии и иммунологии, М., Колос, 1972, с. 117.

2. Международная заявка N 91/01138 "Многостадийный способ тепловой обработки факторов свертывания крови". Опубликовано РЖ ИСМ 1-8-92.

3. Патент РФ N2079552 "Способ инактивации вируса Эбола". Опубликовано БИ 14,97.

4. Патент РФ N2097427 "Способ инактивации вируса СПИДа". Опубликовано БИ 33,97.

5. Catalog JRH Bioscinces. Fetal Bovine Serum Gamma Irradiated, 1998.

6. Европейская заявка N0281978 "Инактивирование вируса СПИД в содержащих белок растворах при помощи фенола". Опубликовано РЖ ИСМ 44-65-89.

Изобретение относится к медицине. Проводится холодовая денатурация вирусных патогенов в препаратах плазмы крови человека, которая находится под повышенным гидростатическим давлением 2500 атм, после чего ее охлаждают до температуры (-15)-(-20)°С. Изобретение может быть использовано для инактивации вирусных патогенов в препаратах плазмы крови с сохранением функциональной активности белковой части препаратов плазмы. 1 табл.

Способ инактивации ВИЧ и других вирусов в плазме крови человека путем воздействия на них физическими факторами, включающими температурную обработку, отличающийся тем, что в качестве физических факторов дополнительно используют повышенное гидростатическое давление до 2500 атм одновременно с температурным воздействием, причем температурное воздействие проводят путем охлаждения плазмы крови до (-15) - (-20)^oC.