СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В ЖИДКОСТЯХ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/536 

Изобретение относится к области медицины, медицинской техники, ветеринарии, экологии и может быть использовано для определения биологически активных веществ в любых биологических жидкостях, окружающей среде, пищевых продуктах, в частности в диагностике вирусных, бактериальных, паразитарных и соматических заболеваний, а также для контроля эффективности лечения.

Известен потенциометрический способ определения антигенов и антител в биологических жидкостях, описанный Коллинзом и Джанатой /1/ и относящийся к электрохимическим способам иммуноанализа. Этот способ требует сенсибилизации электродов антителами или антигеном, что снижает его универсальность и применимость.

Наиболее близким к заявляемому способу является амперометрический способ определения антигенов и антител в биологических жидкостях, включающий взятие пробы, отбор пробы исследуемой жидкости, добавление в контрольную и исследуемую пробы соответствующего реагента антисыворотки или антигена, подачу к контрольному и исследуемому растворам зондирующего тока, инициирующего реакцию. По изменению величины тока определяют специфическую реакцию антиген антитела /2/.

Способ-прототип также предусматривает сенсибилизацию электродов антигеном или антителами. Кроме того, сопутствующие помехи снижают специфичность реакции.

Известно устройство для проведения автоматизированного непрерывного иммуноферментного анализа /3/. Недостатками этого устройства являются большое время для получения результата анализа, сложность устройства, затрудненность автоматизации получения результатов, высокая стоимость.

Известно устройство для иммунокондуктометрической оценки антигенов и антител в растворах биологических жидкостей /4/, принятое за прототип и содержащее последовательно соединенные зонд, детектор, усилитель, а также генератор импульсов зондирующего тока, генератор циклов, блок индикации реакции.

Это устройство не имеет возможностей регулирования временных параметров зондирующих импульсов, что сужает диапазон применения устройства. Большое значение величины зондирующего тока и импульсы прямоугольной формы оказывают неблагоприятное воздействие на ход специфической реакции и снижают чувствительность устройства.

Предлагаемое изобретение в части способа решает задачу повышения универсальности и чувствительности, что увеличивает специфичность определения биологически активных веществ.

Эта задача решается тем, что в способе определения биологически активных веществ в жидкостях, включающем взятие контрольной пробы, отбор исследуемой жидкости, добавление в контрольную и исследуемую пробы соответствующего реагента, подачу к контрольному и исследуемому растворам зондирующего тока, измерение и сравнение электрических параметров контрольного и исследуемого раствора, подачу зондирующего тока осуществляют трапецеидальными пачками импульсов, а в качестве электрических параметров растворов фиксируют разницу электропроводностей.

В заявляемом способе определения биологически активных веществ в жидкостях каждый измерительный цикл, состоящий из пачки импульсов и паузы между пачками, могут осуществлять длительностью от 5 до 100 с, а скважность пачек импульсов могут поддерживать в пределах от 10 до 90%
Предлагаемое изобретение в части устройства решает задачу повышения чувствительности к специфической реакции и расширения функциональных возможностей устройства за счет минимизации воздействия зондирующего тока на течение иммунохимического процесса, снижения приэлектродной поляризации, создания возможности регулирования временных параметров импульсов зондирующего тока.

Эта задача решается тем, что в устройстве для определения специфических антигенов и антител в биологических жидкостях, содержащем последовательно соединенные зонд, детектор, усилитель, а также генератор импульсов зондирующего тока, генератор циклов, счетчик циклов, блок индикации реакции, устройство дополнительно снабжено блоком управления, совмещенным с блоком индикации реакции, формирователем трапецеидальной пачки импульсов, размещенными между генератором импульсов и зондом, усилитель выполнен в виде дифференциального усилителя с элементами аналоговой памяти, зонд выполнен в виде последовательно соединенных датчика электропроводности раствора и усилителя тока датчика, размещенных в вынесенном корпусе, генератор циклов выполнен с возможностью регулирования временных параметров импульсов, при этом вход управления формирователя трапецеидальной пачки импульсов соединен с выходом генератора циклов, выход дифференциального усилителя и выходы управления им соединены с блоком управления и индикации реакции.

На фиг. 1 представлена блок-схема устройства, а на фиг. 2 и 3 схематично изображен зонд.

На фиг. 4 представлены результаты влияния длительности зондирующего импульса и времени экспозиции антигена с текстовыми системами (СЧД - человеческая сыворотка донора контроль, АГ сыворотка больного тест) на интенсивность специфической реакции у больных раком печени при определении альфа-фетопротеина.

На фиг. 5 приведены результаты подбора оптимального разведения сыворотки больного геморрагическим панкреонекрозом при определении полипептида, характеризующего течение болезни.

В качестве реагентов применены сыворотка неиммунного кролика (контроль) и сыворотка иммунного кролика (тест) при различных разведениях.

На фиг. 6 приведены результаты определения антигенов и антител в сыворотке больного туберкулезом.

В качестве контрольного определения использована реакция сыворотки донора на антитела.

По оси ординат отложено изменение электропроводности жидкости, (ΔZ), по оси абсцисс разведение сыворотки больного и донора.

Фиг. 7 иллюстрирует возможность определения специфических реакций в твердофазной системе.

Устройство состоит из генератора циклов 1, формирователя трапецеидальной пачки импульсов 2, генератора импульсов зондирующего тока 3, счетчика циклов 4, датчика электропроводности 5 и усилителя тока датчика 6, размещенных в вынесенном корпусе 14 и образующих зонд 7, детектора 8, дифференциального усилителя 9 с элементами аналоговой памяти: схемой слежения запоминания 10, схемой запоминания начальных условий 11 и компаратором 12, блока управления и индикации 13 (фиг. 1).

Генератор 3, формирователь 2, зонд 7, детектор 8, схема слежения - запоминания 10 и компаратор 11 дифференциального усилителя 9 соединены последовательно, причем формирователь 2 одновременно соединен с генератором циклов 1 и счетчиком циклов 4. Схема запоминания начальных условий 12 параллельно соединена со схемой слежения запоминания 10, компаратором 11 и блоком управления и индикации 13, который в свою очередь параллельно соединен со счетчиком циклов 4 и компаратором 11.

Зонд 7 (фиг. 23) представляет собой конструкцию из последовательно соединенных датчика электропроводности 5 и усилителя тока датчика 6, размещенных в вынесенном корпусе 14. Погружаемая в раствор 15 часть зонда 7 прямоугольной формы выполнена из изоляционного материала, в котором размещены электроды 16, что защищает их от воздушных пузырей и упрощает отмывку активной части зонда 7 от компонентов предыдущих опытов. Датчик 5 погружается в ячейку стандартной плашки 17 для иммунологических исследований, а цилиндрическая часть 18 фиксирует зонд в ячейке плашки 17. Усилитель 6 размещен рядом с электродами 16, что снижает влияние помех и емкости соединительного кабеля и повышает чувствительность устройства. Зонд 7 соединен кабелем 19 с формирователем 2 и детектором 8.

Способ определения биологически активных веществ в жидкостях реализуется следующим образом. Отбираются контрольная проба и проба исследуемой жидкости, в пробы добавляется соответствующий тестовый реагент с заранее подобранной концентрацией. После этого сначала к контрольному, а затем к исследуемому раствору подают зондирующий ток трапецеидальными пачками импульсов. Принимая величину электропроводности контрольного раствора за "нулевой" уровень, определяют электропроводность исследуемого раствора и по разности электропроводностей судят о специфической реакции. При этом каждый измерительный цикл, состоящий из пачки импульсов и паузы между пачками, осуществляют длительностью от 5 до 100 с, а скважность пачек импульсов поддерживают в пределах от 10 до 90%
В зависимости от количественных соотношений реагентов, например антигена и антител одной и той же системы (изменение разведений антигена при постоянной концентрации антител или наоборот), электропроводность может увеличиваться или уменьшаться относительно "нулевого" уровня, что позволяет проводить более информативный, чем в прототипе, качественный анализ искомых компонентов.

Устройство работает следующим образом. При включении его начинают работать генератор импульсов 3, генератор циклов 1, формирователь трапецеидальной пачки импульсов 2, счетчик циклов 4. Пока зонд 7 не опущен в раствор, на выходе усилителя тока датчика 6 напряжение отсутствует. Также отсутствует напряжение и на выходе компаратора 11. При погружении зонда 7 в исследуемый раствор появляется ток на входе усилителя 6, на выходе усилителя 6 появляется усиленный ток, преобразованный в напряжение, которое после детектирования подается на схему сложения-запоминания 10 и далее после компарирования к блоку управления и индикации 11. Перед исследованием биологической жидкости производят измерения контрольного раствора, при этом величина тока, протекающего через контрольный раствор, принимается за "нулевую", а отклонения от нулевой величины при анализе биологической жидкости фиксируются блоком управления и индикации 11. Для проведения измерений относительно контрольного раствора необходимо "запомнить" результаты измерения контрольного раствора с помощью схемы запоминания начальных условий 12. В этом случае не выходе компаратора 11 появится разностный сигнал, соответствующий наличию специфической реакции в растворе, то есть разнице напряжения со схемы 12 и напряжения, соответствующего проводимому анализу.

Генераторы 1, 3 представляют собой мультивибраторы.

Генератор тока 3 работает на частотах 8 25 кГц, форма напряжения прямоугольная, положительной полярности.

Генератор циклов 1 работает с регулируемым периодом повторения от 5 до 100 с и скважностью от 10 до 90% причем период повторения и скважность устанавливаются оператором с учетом особенностей исследуемых жидкостей.

Количество рабочих циклов (от 1 до 10) задается оператором с помощью счетчика циклов 4, который при прохождении заданного количества циклов блокирует генератор циклов 1. С помощью блока управления и индикации 13 можно задавать количество циклов и поддерживать его автоматически, а также отключать автомат. Повторный пуск генератора циклов 1 после автоматической остановки осуществляется кнопкой.

Сигнал с генератора циклов используется как разрешающий в схемах памяти 10, 12 и формирователе 2.

Счетчик циклов 4 состоит их микросхемы счетчика и усилителей тока для индикации количества рабочих циклов.

Формирователь трапецеидальной пачки импульсов 2 представляет собой регулятор напряжения на двух транзисторах, управляемых напряжением с генератора циклов 1 через интегрирующую цепь. Сформированная таким образом трапецеидальная пачка импульсов, не нарушающая в отличие от прямоугольной пачки естественного протекания специфической реакции, поступает на зонд 7.

Операционный усилитель 6 зонда 7 работает в режиме усилителя тока (преобразователь ток напряжение), что позволяет иметь чисто активное и высокое входное сопротивление порядка 100 кОм.

Низкое напряжение, подаваемое на зонд 7 с формирователя 2, и высокое входное сопротивление усилителя 6 ограничивают величину тока через исследуемые растворы на уровне 10 30 мкА, что минимизирует влияние тока на ход специфической реакции и эффект поляризации раствора и электродов.

Частая смена показаний результата анализа, обусловленная циклическим режимом работы прибора, требует введения в схему прибора аналогового запоминающего узла, фиксирующего результат анализа на время паузы. Схема слежения запоминания 10 (конденсатор с малыми потерями и операционный усилитель с большим входным сопротивлением) управляется импульсами генератора циклов 1. На время паузы вход схемы 10 отключается, и результат анализа фиксируется.

С выхода схемы слежения запоминания 10 сигнал поступает на один вход компаратора 11. На другом входе компаратора 11 присутствует напряжение, величина которого соответствует результату предыдущего опыта, зафиксированному схемой запоминания начальных условий 12. Построение схемы 12 аналогично схеме 10, но управляется она оператором, при необходимости "запомнить" начальное условие нужно нажать кнопку. В результате на входах компаратора 11 будут присутствовать напряжения, соответствующие результату контрольного анализа и анализу исследуемого раствора.

Если исследуемый раствор по электрохимическим свойствам отличается от контрольного, на выходе компаратора 11 появится напряжение, пропорциональное различию в растворах.

Блок управления и индикации 13 включает в себя органы регулировок и переключения режимов, а также индикацию режимов работы и результатов анализов.

Для снижения вредного воздействия зондирующего тока на ход специфической реакции и максимального повышения чувствительности в устройстве предусмотрены циклический режим зондирующего тока, подаваемого трапецеидальными пачками импульсов, а также очень малая величина зондирующего тока. Возможность регулирования временных параметров пачек импульсов позволяет "подстраиваться" под различные специфические реакции, что расширяет функциональные возможности устройства.

Результаты, показанные на фиг. 4, свидетельствуют о необходимости проведения измерений после некоторой экспозиции и об удовлетворительных определениях при различных длительностях зондирующего импульса.

Фиг.4
A влияние длительности зондирующего импульса 4 с (2), 12 с (21). Разведения исследуемой и донорской сыворотки одинаковые и составляют 10^-7 степени.

B влияние времени взаимодействия исследуемого материала с тестовой системой (антителами).

22 измерение сразу после добавления антител.

23 измерение через 15 мин.

Разведение исследуемой и донорской сыворотки 10^-6 в опыте Б.

Тестовая антисыворотка разведена в 10^-2 степени.

Фиг. 5
На фиг. 5 представлен пример выбора оптимальных соотношений антигена и антител для конкретной системы (панкреонекроз).

Нормальная кроличья сыворотка (24) в разведении 10^-3 степени и (25) 10^-7 степени, такие же разведения иммунной сыворотки (26) и (27).

По оси абсцисс отложены разведения сыворотки больного.

При этом наибольшая разница в электропроводностях жидкости (ΔZ), отложенная по оси ординат, свидетельствует об оптимальном разведении сыворотки больного, равном 10^-4 (в 10000 раз). Это разведение сыворотки больного применяется при последующих определениях полипептида.

Фиг. 6
На фиг. 6 демонстрируется одновременное выявление в сыворотках больных антител (28) и антигенов (29) при туберкулезной инфекции. 30 донорская сыворотка на выявление антител.

Фиг. 7
На фиг. 7 представлена твердофазная модификация способа выявления антигена (31) инфекционного гепатита.

Моноклональные антитела к антигену вирусного гепатита В (HBS антигену) фиксировали на планшете для иммунологических реакций, разводя их в 1600 раз на карбонат-бикарбонатном буфере. По оси ординат отложена величина ΔZ исследуемой жидкости, по оси абсцисс разведение HBS антигена.

Приведенные примеры свидетельствуют о широком диапазоне применения предлагаемого способа и устройства.

С помощью предлагаемого способа можно проводить диагностику заболеваний человека и животных самой различной этиологии (бактериальной, паразитарной, вирусной, опухолевой, аутоиммуной и др.), прогнозировать течение заболевания и вести контроль за эффективностью лечения.

Способ позволяет выявлять антигены и антитела в любой биологической жидкости плазме и сыворотке крови, моче, молоке, слезах, слюне, мокроте и тканевых выпотах, а также возбудителей болезней в экстрактах и вытяжках плодов, овощей, зерна и т.д.

Возможности способа позволяют использовать его для индикации токсических органических веществ в окружающей среде (почве, воде, воздухе), а также применять для контроля качества пищевых продуктов при их производстве и после определенных сроков хранения.

Источники информации
1. Ganata G. Blackburn G.F. Immunochemical potentiometrik Sensors. Ann. N.Y. Acad. Sci. V. 428, p.286 292, 1984.

Wehmeyer K. R. etal. Competitive heterogeneous enzyme immunoassay for digxin with electrochemical detection, Anal. Chem. V.58, h. 135 139, 1986.

3. Пат. ФРГ N 3122019, кл. А 61 В 5/05, опубл. 1982.

4. Решение о выдаче а.с. СССР по заявке N 4640278/30-14 от 29.08.89.

Использование: изобретение относится к области медицины, медицинской техники, ветеринарии, экологии и может быть использовано в диагностике вирусных, бактериальных, паразитарных, опухолевых, аутоиммунных заболеваний и для контроля эффективности лечения. Сущность: способ определения биологически активных веществ в жидкостях включает в себя взятие контрольной и исследуемой проб, добавление в пробы соответствующего реагента, подачу к контрольному и исследуемому растворам зондирующего тока трапецеидальными пачками импульсов при длительности измерительного цикла от 5 до 100 с и скважности пачек импульсов от 10 до 90%, измерение и сравнение электропроводности контрольного и опытного растворов. Устройство для осуществления способа состоит из генератора циклов 1, формирователя трапецеидальной пачки импульсов 2, генератора импульсов зондирующего тока 3, счетчика циклов 4, датчика электропроводности 5 и усилителя тока датчика 6, размещенных в вынесенном корпусе и образующих зонд 7, детектора 8, дифференциального усилителя 9 с элементами аналоговой памяти - схемой слежения - запоминания 10, схемой запоминания начальных условий 11 и компаратором 12, блока управления и индикации 13, вынесенного корпуса 14 зонда 7, электродов 16 датчика 5. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Способ определения биологически активных веществ в жидкостях, при котором берут контрольную пробу, отбирают пробу исследуемой жидкости, добавляют в контрольную и исследуемую пробы соответствующий реагент, подают к контрольному и исследуемому растворам зондирующий ток, измеряют и сравнивают электрические параметры контрольного и исследуемого раствора, отличающийся тем, что зондирующий ток подают в виде трапецеидальных пачек импульсов, а разницу электропроводностей регистрируют в качестве электрических параметров растворов. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждый измерительный цикл, состоящий из пачки импульсов и паузы между пачками, осуществляют длительностью 5 100 с, а скважность пачек импульсов поддерживают в пределах 10 90%
3. Устройство для определения биологически активных веществ в жидкостях, содержащее последовательно соединенные зонд, детектор, усилитель, а также генератор импульсов зондирующего тока, генератор циклов, счетчик циклов, блок индикации реакции, отличающееся тем, что устройство содержит формирователь трапециеидальной пачки импульсов, размещенный между генератором импульсов и зондом, усилитель выполнен в виде дифференциального усилителя с элементами аналоговой памяти, зонд выполнен в виде последовательно соединенных датчика электропроводности раствора и усилителя тока датчика, генератор циклов выполнен с возможностью регулирования временных параметров импульсов, при этом вход управления формирователя трапецеидальной пачки импульсов соединен с выходом генератора циклов, выход дифференциального усилителя и выход управления им соединены с блоком управления и индикации реакции.