ФЕРМЕНТАЦИОННАЯ СРЕДА ДЛЯ БИОСИНТЕЗА СТРЕПТОМИЦИНА ШТАММОМ STREPTOMYCES GRISEUS Российский патент 1998 года по МПК C12P1/06 C12N1/20 C12P19/54 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к производству антибиотиков, а именно к производству стрептомицина.

Для биосинтеза стрептомицина используются комплексные среды, включающие соевую муку, аммоний сернокислый, калий или аммоний фосфорнокислый, мел, натрий хлористый и источник углерода.

В качестве источника для биосинтеза стрептомицина испытано много веществ - глицерин, маннит, фруктоза, манноза, глюкоза, мальтоза, декстрин, крахмал, жир [1] . Наивысшая активность получена при использовании глюкозы - 9000 мкг/мл на среде с 7% глюкозы [2]. Указанная среда выбрана в качестве прототипа.

Недостатком прототипа является низкий уровень образования стрептомицина.

Цель предлагаемого изобретения - повышение уровня образования стрептомицина при биосинтезе.

Указанная цель достигается использованием новой ферментационной среды, в которой источником углерода служит смесь глюкозы с другим углеводом или глицерином. Это позволяет значительно (до 30-40%) повысить выход антибиотика в процессе ферментации. Положительный эффект подтвержден на примере трех штаммов продуцентов стрептомицина, относящихся к виду Streptomyces griseus - C-5, C-6 и C-7. Максимальный уровень образования стрептомицина - 28000 мкг/мл - получен со штаммом C-7 на среде с 5,5% глюкозы и 5,5% крахмала (общее содержание углеводов 11%, см. пример 3). Полученный эффект можно объяснить более точной настройкой метаболизма штаммов продуцентов на биосинтез стрептомицина при использовании в ферментационной среде смеси определенных источников углерода в определенном соотношении и количестве.

В общедоступной литературе мы не нашли сведений об использовании при биосинтезе стрептомицина сред с двумя углеводами или смесью углевода и глицерина. Таким образом, предлагаемое изобретение обладает новизной.

Ввиду широкого использования в здравоохранении и большой коммерческой значимости антибиотиков, вопросам их биосинтеза посвящено огромное количество работ (см. , например, [3]). До сих пор, однако, не создано надежной теоретической базы, указывающей закономерный путь оптимизации состава питательных сред для биосинтеза. Как и создание штаммов продуцентов, создание ферментационных сред до сих пор в значительной мере эмпирический процесс. Один и тот же подход может дать совершенно разные результаты не только в применении к продуцентам разных антибиотиков, но и в случае разных штаммов продуцентов одного и того же антибиотика. Следовательно, использованный для создания изобретения подход (замена части глюкозы в среде на другой углевод или глицерин) не следует явным образом из уровня техники.

Пример 1.

Продуцент стрептомицина Streptomyces griseus штамм C-5 (использованный в процессе по прототипу штамм-продуцент недоступен, поэтому в примере использован доступный штамм C-5 с близким уровнем активности) выращивают в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих 80-100 мл среды следующего состава (по прототипу, в %): глюкоза - 4, декстрин - 0,2, соевая мука - 3, [NH₄]₂SO₄ - 0,55, KH₂PO₄ - 0,005, NaCl - 0,2, CaCO₃ - 0,65, вода - остальное. Процесс роста продолжается 48 ч при 26^oC на качалке. Затем инокулюм в количестве 20-25% переносят в колбы Эрленмейера, содержащие 50 мл ферментационной среды следующего состава (по прототипу, в %): глюкоза - 7, соевая мука - 3, [NH₄] ₂SO₄ - 1,05, NaCl - 0,25, KH₂PO₄ - 0,0025, CaCO₃ - 0,9, вода - остальное. Ферментация протекает при 26^oC. Уровень образования стрептомицина - 10000 мкг/мл.

Пример 2.

Посевной материал штамма C-5 выращивают по примеру 1. Ферментацию проводят как в примере 1, но на средах иного состава. Изменяется суммарное содержание источников углерода в среде и их сочетание, а также концентрация всех прочих веществ. Составы сред и соответствующие им уровни образования стрептомицина приведены в табл. 1 и примечаниях к ней.

Превышение активности на средах с двумя источниками углерода колеблется от 7% (глюкоза + глицерин) до 23% (глюкоза + лактоза).

Пример 3.

Для биосинтеза используется штамм C-6. Выращивание посевного материала и ферментацию осуществляют как в примере 2. Уровни образования стрептомицина приведены в табл. 2.

Превышение активности на средах с двумя источниками углерода колеблется от 11% (среды с глицерином, фруктозой, галактозой, лактозой) до 25% (среда с мальтозой).

Пример 4.

Для биосинтеза стрептомицина используется штамм C-7. Выращивание посевного материала и ферментацию проводят как в примере 2. Уровни образования стрептомицина приведены в табл. 3.

Превышение активности колеблется от 9,5% (среда с глицерином) до 33% (среда с крахмалом).

Литература
1. Demain A. L. and E.Inamine (1970). Biochemistry and regulation of streptomycin and mannosidostreptomycinase formation. - Bacteriol. Rev., Vol. 34, No. 1, pp.1-19.

2. Singh A. , E.Bruzelius and H.Heding (1976). Streptomycin. A fermentation study. - Eur. J.Appl. Microbiol., Vol. 3, N 2, pp.97-101 (прототип)
3. Murray Moo-Young, ed. (1985). Comprehensive Biotechnology, Vol.3. - Pergamon Press. Oxford, New York, Toronto, Sydney, Frankfurt.

Изобретение относится к биотехнологии, к биосинтезу антибиотика стрептомицина штаммом streptomyces griseus. Для этого используется ферментационная среда, содержащая смесь глюкозы с другим углеводом (фруктоза, галактоза, мальтоза, лактоза, декстрин, крахмал), или смесь глюкозы с глицерином в соотношении 9:1 - 1:9, соответственно. Среда содержит также соевую муку, сульфат аммония, аммоний, (или калий) фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, карбонат кальция и воду. Среда позволяет повысить уровень образования стрептомицина при биосинтезе. 3 табл.

Ферментационная среда для биосинтеза стрептомицина штаммом Streptomyces griseus, содержащая источники углерода, соевую муку, сульфат аммония, аммоний или калий фосфорно-кислый двузамещенный, натрий хлористый, карбонат кальция и воду, отличающаяся тем, что в качестве источника углерода она содержит смесь глюкозы с другим углеводом, выбранным из группы фруктоза, галактоза, мальтоза, лактоза, декстрин, крахмал, или смесь глюкозы с глицерином в соотношении 9 : 1 - 1 : 9 соответственно при следующем соотношении компонентов, %:
Смесь глюкозы с другим углеводом или глицерином - 7 - 15
Соевая мука - 2 - 6
Сульфат аммония - 1,5 - 2,5
Аммоний (или калий) фосфорнокислый двузамещенный - 0,06 - 0,12
Натрий хлористый - 0,1 - 0,5
Карбонат кальция - 1,0 - 2,5
Вода - Остальноеа