СПОСОБ ИММУНОМОДУЛЯЦИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1998 года по МПК A61K49/00 A61K39/04 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может быть использовано в иммунологии, онкологии, микробиологии, биологии, патофизиологии, фтизиатрии для разработки новых способов лечения.

Известно, что некоторые ксенобиотики, например бензин, толуол, фенол и др. могут в зависимости от длительности воздействия оказывать как угнетающее, так и стимулирующее воздействие на иммунный статус экспериментальных животных. Среди ксенобиотиков наиболее распространенными в биосфере являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), которые благодаря хорошей растворимости в липидах легко проникают в организм и интенсивно обезвреживаются во многих органах и тканях. Однако при интенсивном и длительном поступлении ПАУ в организм процессы обезвреживания могут сопровождаться повреждением клеточных структур, особенно мембран и ядерного аппарата клеток, что лежит в основе повреждающего воздействия (ПАУ) (в частности, их канцерогенного и мутагенного эффектов).

Известен способ иммуностимуляции экспериментальных животных (как частный случай иммуномодуляции), согласно которому на организм длительно воздействуют одним из ПАУ, а именно бенз(а)пиреном в течение одного месяца (И.Е. Ковалев, Н.В.Шипулина, Н.Ю.Томилина Индукция цитохрома Р-450 и последующая индукция иммунного ответа у крыс при хроническом введении ксенобиотиков. Фармакология и токсикология, 1990, т.53, N 1, с.51-53).

По известному способу иммуностимулирующий эффект выражается в усилении функции лимфоцитов, но при этом полностью сохраняется повреждающий эффект, вызываемый воздействием ПАУ на организм. Кроме того, происходит усиление аутоагрессивных процессов, в частности увеличение иммунных комплексов, что приводит к повреждению метаболизирующих ПАУ тканей. Выделенные особенности этого способа не позволяют судить о направленности иммуностимулирующего эффекта, поэтому как иммуностимулирующее средство ПАУ могут быть неадекватны по отношению к поврежденному воздействию и не устранять нарушения иммунного статуса в предполагаемом направлении. Указанный способ выбран в качестве прототипа к заявляемому способу.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в оптимизации иммуномодулирующего эффекта и нивелировании патогенетических механизмов, вызванных длительным воздействием ПАУ.

Для решения этой задачи при способе иммуномодуляции у экспериментальных животных путем длительного воздействия ПАУ согласно изобретению после воздействия ПАУ вводят вирулентный штамм микобактерий туберкулеза (МБТ) в большой дозе, а ПАУ воздействует в течение 4-12 мес.

Автором обнаружено, что воздействие ПАУ, начиная с четырехмесячного срока, связано в постепенной адаптацией животных к введению ксенобиотиков и сопровождается стимуляцией клеточного звена иммунитета.

У животных, подвергающихся длительному воздействую ПАУ в течение 4-12 мес. , автором экспериментально выявлено усиление биосинтеза аргинина в печени, а также увеличение этой аминокислоты в крови, легких, костном мозге, селезенке. Кроме этого, в кроветворных органах значительно возрастает содержание метионина.

Аргинин и метионин, как известно, являются предшественниками полиаминов - стимуляторов и регуляторов пролиферативных процессов, а также обладают иммуномодулирующим эффектом. Очевидно, с этими метаболическими перестройками и связаны выявленные иммуностимулирующие изменения. Кроме того, известно, что увеличение аргинина в ткани легкого способствует преципитации здесь иммунных комплексов с повреждением ткани легкого (Muligan Michael S., Hevel Joan M., Marletta Michael S., Ward Peter A. Tissue injury caused by deposition of immune complexes is L-arginine-dependent. //Proceeding of National Academy Sciences of U. S. A. - 1991, vol. 88 N 14, p. 6338-6342). Поэтому наблюдаемая стимуляция иммунного ответа как его клеточного, так и гуморального звеньев может носить аутоагрессивный характер и лежать в основе повреждающего действия ПАУ на организм.

Введение вирулентного штамма МБТ в большой дозе после длительного воздействия ПАУ в течение 4-12 мес. изменяет иммунограмму экспериментальных животных, которая приближается к контрольной по клеточному звену иммунитета и значительно ее превосходит по показателям гуморального иммунитета. При этом содержание аргинина в легких и селезенке падает; в костном мозге аргинин и метионин сохраняются на высоком уровне. Очевидно, что указанные изменения препятствуют реализации повреждающих механизмов воздействия ПАУ на организм за счет переключения адаптивных механизмов, развивавшихся вследствие длительного контакта с ПАУ и введения МБТ.

Большая доза вирулентного штамма МБТ выбрана с целью максимального воздействия на адаптивные механизмы. Небольшие дозы МБТ или маловирулентные штаммы не влияют так существенно на биохимические процессы в организме и, следовательно, не в состоянии изменить направленность адаптивных процессов, значительно модифицированных веществами типа ПАУ. У животных, подвергшихся только заражению МБТ в большой дозе, наблюдается полное подавление иммунного ответа, при этом установлено значительное снижение аргинина и метионина в кроветворных органах по сравнению с контролем.

Автором установлено, что отчетливая стимуляция гуморального звена иммунитета при сохранении на достаточно высоком уровне его клеточного звена выявляется в сроке воздействия ПАУ от 4 до 12 мес. Свыше 12 мес. характер изменений иммунологических показателей остается постоянным, кроме того, в более позднем сроке могут сказываться факторы старения организма экспериментальных животных.

Способ осуществляют следующим образом. Группам морских свинок периодически вводят в трахею под эфирным наркозом разовую дозу ПАУ в виде смеси: каменноугольная смола (КС) 5% раствор в подсолнечном масле 0,5 мл и 0,1%-ный раствор сажи (газовая и ламповая поровну) в физиологическом растворе 0,5 мл. После длительного воздействия КС и сажей суммарной дозой 200 мг животным вводят вирулентный штамм МБТ в дозе 0,1 мг в паховую складку. Для наглядности и быстроты проведения эксперимента был выбран вирулентный штамм H₃₇Rv - человеческий вирулентный штамм, который при заражении морских свинок приводит к быстрой генерализации экспериментального туберкулеза с подавлением иммунологической резистентности указанных животных (В.И.Пузик Проблемы иммуноморфологии туберкулеза. М.: Медицина, 1966, с. 180).

После проведения способа у животных исследовали иммунограмму крови, содержание свободных аминокислот в тканях. Динамика иммунологических показаний представлена в табл. 1, а содержание аргинина и метионина в органах представлено в табл. 2.

Пример 1. Наблюдали 2 группы животных: контрольную группу (интактные животные) и группу морских свинок, подвергшихся воздействию КС и сажи в течение 2 мес. с интенсивностью введения разовой дозы 1 раз в неделю (1 группа - по прототипу). Введение ПАУ сопровождалось угнетением клеточного звена иммунитета: по отношению к контролю снижается процент Т-лимфоцитов, супрессоров, но увеличивается титр противотуберкулезных антител и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) (табл. 1). Титр гамма-глобулинов при этом возрастает.

Пример 2. Взяты следующие группы животных: контрольная группа (интактные животные - 0 группа), группа морских свинок, на которых воздействовали КС и сажей в течение 4 мес. (2 группа - по прототипу) и группа животных, подвергавшаяся воздействию ПАУ в течение 4 мес. с интенсивностью введения разовой дозы 2 раза в месяц с последующим введением вирулентного штамма H₃₇Rv в дозе 0,1 мг (3 группа - по предлагаемому способу).

У животных 2-й группы (по прототипу) наблюдались следующие изменения в иммунограмме (табл. 1): процент Т-лимфоцитов снижается в 1,5 раза по отношению к контрольным значениям, существенно также снижение супрессоров, а увеличен уровень "0"-лимфоцитов, имелась тенденция к снижению титра противотуберкулезных антител и ЦИК. Эта картина соответствует стимуляции клеточного звена иммунитета при угнетении гуморального ответа.

Сравнивая показатели 2-й и 3-й групп (табл. 1), видим, что в 3 группе процент Т-лимфоцитов, хелперов, супрессоров увеличивается, резко возрастает процент В-лимфоцитов, титр противотуберкулезных антител и ЦИК. Такое соотношение иммунологических показателей свидетельствует о некотором нивелирующем воздействии на нарушение иммунного статуса морских свинок при данном режиме воздействия КС и сажи в сочетании с МБТ и усилении как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета.

Пример 3. Под наблюдением находились две группы морских свинок: контрольная группа животных (интактные животные) и экспериментальная группа, подвергавшаяся воздействию КС и сажи в течение 8 мес. с интенсивностью введения разовой дозы 1-2 раза в месяц с последующим введением штамма МБТ H₃₇Rv в дозе 0,1 мг (по предлагаемому способу).

Введение КС и сажи в течение 8 мес. приводит к противоположным по направленности сдвигам в иммунограмме по сравнению с показателями серии опытов, когда ПАУ вводились не более 4 мес. Процент Т-лимфоцитов становится выше контрольных значений, существенно по сравнению с контролем увеличивается процент хелперов, а процент супрессоров приближается к контрольному уровню. Это свидетельствует о значительной стимуляции клеточного звена иммунитета. Одновременно выше контрольных значений увеличивается процент В-лимфоцитов, однако титр противотуберкулезных антител, гамма-глобулинов и ЦИК крови снижается, также значительно снижен процент "0"-лимфоцитов. У этой группы морских свинок отмечается увеличение аргинина в печени, легких, костном мозге, селезенке, крови. Кроме того, в кроветворных органах значительно возрастает содержание метионина (табл. 2).

Введение вирулентного штамма H₃₇Rv в большой дозе (0,1 мг) экспериментальной группе животных, получавших КС и сажу, несколько снижает процент Т-лимфоцитов (до уровня контрольных значений), а процент В-лимфоцитов отчетливо увеличивается одновременно с титром противотуберкулезных антител и ЦИК, процент хелперов несколько снижается, в то же время процент "0"-лимфоцитов остается на низком уровне. При этом содержание аргинина в легких и селезенке резко падает, в костном мозге аргинин и метионин сохраняются на высоком уровне. Во 2-й и 3-й группах эта динамика выражена гораздо менее отчетливо.

Приведенные данные из табл. 1 и 2 свидетельствуют об оптимизации иммуномодулирующего эффекта и нивелировании патогенетических механизмов, вызванных воздействием ксенобиотиков при использовании заявляемого способа. Дополнительно это подтверждается и усилением фагоцитарной активности в крови и бронхиальных смывах, при этом в костном мозге стимулируется моноцитарный росток кроветворения.

Следовательно, предлагаемый способ обладает качественным преимуществом по сравнению со способом по прототипу, что выражается в нивелировании патогенетических механизмов повреждающего действия ПАУ и возможности мониторинга иммунного ответа организма. Тем самым улучшается клиническое состояние животных, их выживаемость и возможность использования их при экспериментальном моделировании.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет оптимизировать иммуномодулирующий эффект с отчетливой стимуляцией гуморального звена иммунитета при сохранении на достаточно высоком уровне его клеточного звена, а также нивелировать повреждающее воздействие ПАУ с улучшением иммунологических и биохимических показателей, усилением фагоцитарной активности клеток.

Предлагаемый способ может быть использован в экспериментальной медицине при разработке способов борьбы с иммунодефицитами, особенно инфекционной этиологии, а также с иммунодефицитами, вызванными воздействием ксенобиотиков.

Способ предназначен для иммуномодуляции у экспериментальных животных путем воздействия полициклическими ароматическими углеводородами. На морскую свинку воздействуют полициклическими ароматическими углеводородами в течение 4-12 мес. суммарной дозой 200 мг. После воздействия животному вводят вирулентный штамм H₃₇Rv микобактерий туберкулеза в дозе 0,1 мг. Способ позволяет оптимизировать иммуномодулирующий эффект, нивелировать повреждающее воздействие полициклических ароматических углеводородов. 2 табл.

Способ иммуномодуляции у экспериментальных животных путем воздействия полициклическими ароматическими углеводородами, отличающийся тем, что на морскую свинку воздействуют полициклическими ароматическими углеводородами в течение 4 - 12 месяцев суммарной дозой 200 мг, после чего животному вводят вирулентный штамм H₃₇Rv микобактерий туберкулеза в дозе 0,1 мг.