ШТАММ БАКТЕРИЙ CITROBACTER DIVERSUS, ОБЛАДАЮЩИЙ КОМПЛЕКСОМ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 A61K39/40 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ-энтеротоксина) и анатоксина Citrobacter diversus при производстве вакцин.

Целью изобретения является штамм Citrobacter diversus 930, обладающий повышенной токсинопродуцирующей способностью.

Штамм Citrobacter diversus N 930 выделен от больного с кишечной инфекцией в 1993 г. депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича и имеет регистрационный номер 244.

Штамм Citrobacter diversus ГИСК N 244 характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

При выращивании на обычных универсальных питательных средах при температуре 35-36^oC штамм на поверхности питательной среды растет с образованием крупных колоний. При выращивании в бульоне Хоттингера (pH 7,2-7,4), температура 35-36^oC, в течение 20 ч вызывает равномерное помутнение с выпадением осадка.

Способы определения активности ЛТ-энтеротоксина:
субплантарное введение мышам весом 15-16 г 0,05 мл центрифугата 20-40-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки не менее 120 мг. Аксенова Е.В. 1980;
интраназальное введение 0,05 мг 20-40-часовой бульонной культуры вызывает гибель 95% мышей-самцов весом 15-16 г в течение 20 мин при явлениях тонических судорог и асфиксии, Войно-Ясенецкая Н.К. 1967;
внутримышечное введение 300 млн. микробных клеток 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром 3,5 см;
в опыте петля тонкой кишки кролика при введении 500 млн. м.т. 20-часовой бульонной культуры дает положительный результат (v/l=1,2);
гретый при 56^oC в течение 45 мин центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки мышей до 30 мг, не вызывая некроза кожи кролика. Гретая при 100^oC 20-часовая культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кролика (v/l=0,3).

Условия хранения культуры после леофильной сушки при выращенной в 0,3% -ном МПА (pH 7,2-7,4), залитым стерильным вазелиновым маслом, при температуре 4^oC.

Среды для размножения бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4), содержащий 5% эритроцитов кролика при температуре 35-36^oC в течение 20 ч.

Генетические особенности.

Устойчив к пенициллину, тетрациклину, линкомицину, эритромицину, левомицетину, ампициллину.

Пример 1. 0,1 мл 1 млрд. суспензии суточной агаровой культуры в физиологическом растворе сеют в стерильный бульон Хоттингера (5 мл pH 7,2-7,4), инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 ч, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 7 мин. Полученную надосадочную жидкость (центрифугат) в объеме 0,05 мл вводят субпланарно в заднюю левую лапку мышей-самцов весом 15-16 г. Через 24 ч животных умерщвляют эфиром и ампутированные по голеностопному суставу взвешивают на торзионных весах, при этом центрифугат штамма Citrobacyer diversus ГИСК N 244 давал разницу между левой и правой лапками не менее 120 мл, остальные 20 штаммов, способные продуцировать ЛТ-энтеротоксин от 65 до 90 мг. Контроли нативный стерильный бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4) и гретый при 56^oC центрифугат 20-часовой бульонной культуры 30-35 мг соответственно.

Результаты приведены в таблице.

Пример 2. 0,1 мл 1 млрд. суспензии суточной агаровой культуры сеют в бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4), инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 ч и 500 млн. м.т. суспензию в объеме 1 мл вводят в сегмент изолированной петли тонкого кишечника кролика. Через 16 ч животных умерщвляют воздушной эмболией и рассчитывают соотношение объема эксудата к длине сегмента (v/l). При этом 20-часовая бульонная культура штамма Citrobacyer diversus ГИСК N 244 оказалась способной давать накопление жидкости в большом количестве, и показатель v/l составил 1,2. У остальных 20 штаммов, способных продуцировать ЛТ-энтеротоксин, показатель v/l колебался в пределах 0,9-1,0. При введении стерильного бульона Хоттингера и гретой при 100^oC 20-часовой бульонной культуры отношение объема накопленной жидкости к длине сегмента составило 0,25 и 0,3 соответственно.

Использование: биотехнология, термолабильный энтеротоксин, ЛТ-энтеротоксин, анатоксин, Citrobacter diversus, вакцина. Сущность изобетения: новый штам Citrobacter diversus 930 обладает повышенной токсинопродуцирующей способностью. Штамм депонирован в коллекции ГИСК и имеет регистрационный номер 244. Штамм может быть использован для получения термолабильного энтеротоксина и анатоксина при производстве вакцин. 1 табл.

Штамм бактерий Citrobacter diversus ГИСК N 244, обладающий комплексом факторов патогенности.