ШТАММ БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER GEG ROVIAE ГИСК N259, ОБЛАДАЮЩИЙ КОМПЛЕКСОМ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть 1 использовано для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ- энтеротоксина) и анатоксина Enterobacter gergoviae при производстве вакцин.

Техническим результатом является штамм Enterobacter gergoviae N 185, обладающий повышенной токсинопродуцирующей способностью.

Штамм Enterobacter gergoviae N 185 выделен из испражнений больного с микозом стоп в 1998 г. в городской больнице г.Ишимбая Республики Башкортостан, депонирован в коллекции государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича и имеет регистрационный номер 259.

Штамм Enterobacter gergoviae ГИСК N 259 характеризуется следующими признаками:
Культуральные признаки.

При выращивании на обычных питательных средах, при температуре 37^oC штамм на поверхности питательной среды растет с образованием характерных изолированных колоний с желтоватым оттенком. При выращивании в бульоне Хоттингера (pH 7,2), при температуре 37^oC, в течение 24 ч вызывает равномерное помутнение с выпадением осадка.

Способы определения активности ЛТ-энтеротоксина:
Субплантарное введение мышам весом 15-16 г 0,05 мл центрифугата 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки мышей более 91 мг. Аксенова Е.В. 1980 г.

Интраназальное введение 0,05 мг 20-часовой бульонной культуры вызывает гибель 95% мышей-самцов весом 15-16 г в течение 2 часов 30 минут при явлениях тонических судорог и асфиксии; Войно-Ясенецкая Н.К. 1967 г.

Внутрикожное введение 300 млн. микробных клеток 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром 3,0 см;
В опыте петля тонкой кишки кролика при введении 500 млн. м.т. 20-часовой бульонной культуры дает положительный результат (V/L=1,3)
Гретый при 56^oC в течение 45 минут центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки мышей до 30 мг, не вызывая некроза кожи кролика. Гретая при 100^oC 20-часовая культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кролика (V/L=0,3).

Условия хранения культуры после леофильной сушки при выращенной в 0,3, %-ном МПА (pH 7,2), залитым стерильным вазелиновым маслом, при температуре 4^oC.

Среды для размножения - бульон Хоттингера (pH 7,2), содержащий 5% эритроцитов кролика при температуре 37^oC в течение 24 часов.

Генетические особенности: Hly+, Ent+, MS+, MR+.

Устойчив к пенициллину, тетрациклину, цефалексину, олеандомицину, оксациллину, эритромицину, левомицетину, карбенициллину.

Пример 1.

0,1 мл 1 млрд. суспензии суточной агаровой культуры в физиологическом растворе сеют в стерильный бульон Хоттингера (5 мл pH 7,2,) инкубируют в термостате при 30^oC в течение 20 часов, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 7 минут. Полученную надосадочную жидкость (центрифугат) в объеме 0,05 мл вводят субплантарно в заднюю левую лапку мышей-самцов весом 15-16 г. Через 24 часа животных умерщвляют эфиром и ампутированные по голеностопному суставу лапки взвешивают на торсионных весах, при этом центрифугат штамма Enterobacter gergoviae ГИСК N 259 давал разницу между левой и правой лапками более 91 мг, остальные 20 штаммов, способные продуцировать ЛТ-энтеротоксин,- от 65 до 90 мг. Контроли - нативный стерильный бульон Хоттингера (pH 7,2) и гретый при 56^oC центрифугат 20-часовой бульонной культуры 30-35 мг, соответственно.

Результаты приведены в таблице N 1.

Пример 2.

0,1 мг 1 млрд. суспензии суточной агаровой культуры сеют в бульон Хоттингера ( pH 7,2), инкубируют в термостате при 30^oC в течение 20 ч и 500 млн. м.т. суспензию в объеме 1 мл вводят в сегмент изолированной петли тонкого кишечника кролика. Через 16 часов животных умерщвляют воздушной эмболией и рассчитывают соотношение объема экссудата к длине сегмента (V/L). При этом 20-часовая бульонная культура штамма Enterobacter gergoviae ГИСК N 259 оказалась способной давать накопление жидкости в большом количестве и показатель V/L составил 1,3. У остальных 20 штаммов способный продуцировать ЛТ-энтеротоксин показатель V/L колебался в пределах 0,9-1,0. При введении стерильного бульона Хоттингера и гретой при 100^oC 20-часовой бульонной культуры отношение объема накопленной жидкости к длине сегмента составило 0,25 и 0,3, соответственно.

Изобретение предназначено для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ-энтеротоксин) и анатоксина Enterobacter gergoviae при производстве вакцин. Штамм Enterobacter gergoviae N 185 выделен из испражнений больного с микозом стоп, депонирован в коллекции государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им Л.А.Тарасевича и имеет регистрационный номер 259. Внутрикожное введение 300 млн. микробных клеток 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром 3,0 см. В опыте петля тонкой кишки кролика при введении 500 млн м.т. 20-часовой бульонной культуры дает положительный результат (V/L = 1,3). Гретый при 56^oС в течение 45 мин центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки мышей до 30 мг, не вызывая некроза кожи кролика. Гретая при 100^oС 20-часовая культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кролика (V/L = 0,3). Среды для размножения - бульон Хоттингера (pH 7,2), содержащий 5% эритроцитов кролика при температуре 37^oС в течение 24 ч. Генетические особенности : Hly+, Ent+, MS+, MR+. Устойчив к пенициллину, тетрациклину, цефалексину, олеандомицину, оксациллину, эритромицину, левомицетину, карбенициллину. Штамм Enterobacter gergoviae ГИСК N 259 обладает повышенной токсинопродуцирующей способностью. 1 табл.

Штамм бактерий Enterobacter geg roviae ГИСК N 259, обладающий комплексом факторов патогенности.