ШТАММ БАКТЕРИЙ CITROBACTER DIVERSUS N 256, ОБЛАДАЮЩИЙ КОМПЛЕКСОМ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ Российский патент 2001 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина (LT-энтеротоксина) и анатоксина при производстве вакцин, а также может использоваться как эталонный штамм Citrobacter diversus.

Техническим результатом является штамм Citrobacter diversus N 719, обладающий комплексом факторов патогенности.

Штамм был выделен из испражнений больного с острой кишечной инфекцией в 1998 году в Республиканской клинической больнице им. Г.Г. Куватова г. Уфы и депонирован в коллекции государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича и имеет регистрационный номер 256. Citrobacter diversus ГИСК N 256 характеризуется следующими признаками:
Культуральные признаки: растет на обычных универсальных плотных питательных средах с образованием характерных изолированных колоний. В мясопептонном бульоне вызывает равномерное помутнение с выпадением осадка и образованием пленки на поверхности.

Способы определения активности LT-энтеротоксина:
Субплантарное (модель отека лапки) введение мышам весом 15-16 г 0,05 мл центрифугата 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки с разницей более 120 мг.

Интраназальное (Войно-Ясенецкая Н.К. 1967 г.) введение 80 млн м.т. вызывает гибель 95% мышей-самцов весом 15-16 г в течение 1 часа 30 минут.

Внутрикожное введение 300 млн микробных клеток 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром более 3,5 см.

В опыте петли тонкой кишки кролика при введении штамма в концентрации 500 млн м.т. дает положительный результат (V/L =1,2).

Гретый при 56^oC в течение 45 мин центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки мышей до 30 мг, не вызывает некроз кожи кролика. Гретая при 100^oC 20-часовая культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кролика (V/L=0,3).

Условия хранения: при температуре 4^oC культура после леофильной сушки или выращенной в 0,3% МПА (pH 7,2-7,4) и залитая стерильным вазелиновым маслом. Условия и состав среды для размножения - бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4) 1,5% МПА при температуре 37^oC в течение 18-24 часов.

Пример 1. 0,1 мл 1 млрд суспензии суточной агаровой культуры в физиологическом растворе сеют в стерильный бульон Хоттингера (5 мл pН 7,2-7,4) инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 часов, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 7 минут. Полученную надосадочную жидкость (центрифугат) в объеме 0,05 мл вводят субплантарно в заднюю левую лапку мышей-самцов весом 15-16 г. Через 24 часа животных умерщвляют эфиром и ампутированные по голеностопному суставу лапки взвешивают на торсионных весах. При этом центрифугат штамма ГИСК N 256 давал разницу между левой и правой лапками более 120 мг. Контроли - нативный стерильный бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4) и гретый при 56^oC центрифугат 20-часовой бульонной культуры 30-35 мг.

Пример 2. 0,1 мг 1 млрд суспензии суточной агаровой культуры сеют в бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4), инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 ч и 500 млн м.т. суспензию в объеме 1 мл вводят в сегмент изолированной петли тонкого кишечника кролика. Через 16 часов животных умерщвляют воздушной эмболией и рассчитывают соотношение объема экссудата к длине сегмента (V/L). При этом 20-часовая бульонная культура штамма ГИСК N 256 оказалась способной давать накопление жидкости в большом количестве и показатель V/L составил 1,2. При введении стерильного бульона Хоттингера и гретой при 100^oC 20-часовой бульонной культуры отношение объема накопленной жидкости к длине сегмента составило 0,25 - 0,3 соответственно.

Изобретение предназначено для получения термолабильного энтеротоксина и анатоксина Citrobacter diversus при производстве вакцин. Штамм был выделен из испражнений больного с острой кишечной инфекцией, депонирован в коллекции государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича и имеет регистрационный номер 256. Citrobacter diversus ГИСК N 256 характеризуется следующими признаками: растет на обычных универсальных плотных питательных средах с образованием характерных изолированных колоний. В мясопептонном бульоне вызывает равномерное помутнение с выпадением осадка и образованием пленки на поверхности. Субплантарное (модель отека лапки) введение мышам весом 15 - 16 г 0,05 мл центрифугата 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки с разницей более 120 мг. Интраназальное введение 80 млн м.т. вызывает гибель 95% мышей-самцов весом 15 - 16 г в течение 1 ч 30 мин. Внутрикожное введение 300 млн микробных клеток 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром более 3,5 см. В опыте петли тонкой кишки кролика при введении штамма в концентрации 500 млн м.т. дает положительный результат (V/L = 1,2). Гретый при 56^oC в течение 45 мин центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки мышей до 30 мг, не вызывает некроз кожи кролика. Гретая при 100^oC 20-часовая культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кролика (V/L = 0,3). Условия и состав среды для размножения - бульон Хоттингера (pH 7,2 -7,4) 1,5% МПА при температуре 37^oC в течение 18 - 24 ч. Штамм бактерий Сitrobacter diversus ГИСК N 256 обладает повышенной токсинпродуцирующей способностью.

Штамм бактерий Citrobacter diversus ГИСК 256, обладающий комплексом факторов патогенности.