ШТАММ БАКТЕРИЙ RETTGERELLA RETTGERI, ОБЛАДАЮЩИЙ КОМПЛЕКСОМ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 A61K39/40 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ-энтеротоксина) и анатоксина Rettgerella reftgeri при производстве вакцин.

Целью изобретения является штамм N 689 обладающий повышенной токсинопродуцирующей способностью.

Штамм Rettgerella reftgeri N 689выделен от больного с дисбактериозом в 1993 г. депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича и имеет регистрационный номер 243.

Штамм Rettgerella reftgeri ГИСК N 243 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки при окраске по Граму грамотрицательные палочки располагаются в мазке отдельно или попарно. В нативном препарате подвижные.

Культуральные признаки.

При выращивании на 1,5%-ном мясопептонном агаре (pH 7,2-7,4) при 35-36^oC штамм на поверхности питательной среды растет с образованием крупных колоний, имеющих ровные края. При выращивании в бульоне Хоттингера (pH 7,2-7,4), 35-36^oC в течение 20 ч. дает диффузное помутнение с выпадением осадка.

Способы определения активности ЛТ-энтеротоксина:
субплантарное введение мышам весом 15-16 г 0,05 мл центрифугата 20-40-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки не менее 100 мг, Аксенова Е. В. 1980 г.

интраназальное введение 0,05 мг 20-40-часовой бульонной культуры вызывает гибель 95% мышей-самцов весом 15-16 г в течение 17 мин при явлениях тоноческих судорог и асфиксии, Войно-Ясенецкая Н.К. 1957 г.

внутримышечное введение 300 млн. микробных клеток 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром более 3,5 см;
в опыте петля тонкой кишки кролика при введении 500 млн. м.т. 20-часовой бульонной культуры дает положительный результат (v/l=1,3);
гретый при 56^oC в течение 45 мин центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки мышей до 30 мг, не вызывает некрозы кожи кролика. Гретая при 100^oC 20-часовая бульонная культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кролика (v/l=0,3).

Условия хранения культуры после леофильной сушки при выращенной в 0,3% -ном МПА (pH 7,2-7,4), залитом стерильным вазелиновым маслом, при температуре 4^oC.

Среды для размножения бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4), содержащий 50 эритроцитов кролика при 35-36^oC в течение 20 ч.

Генетические особенности.

Устойчив к пенициллину, линкомицину, эритромицину, гентамицину.

Пример 1. 0,1 мл 1 млрд. суспензии суточный агаровой культуры в физиологическом растворе сеют в стерильный бульон Хоттингера (5 мл pH 7,2-7,4) инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 ч, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 7 мин. Полученную надосадочную жидкость (центрифугат) в объеме 0,05 мл вводят субплантарно в заднюю левую лапку мышей-самцов весом 15-16 г. Через 24 ч животных умертвляют эфиром и ампутированные по голеностопному суставу лапки взвешивают на тормозионных весах. При этом центрифугат штамма Rettgerella rettgeri ГИСК N 243 давал разницу между левой и правой лапками не менее 100 мл, остальные 20 штаммов, способные продуцировать ЛТ-энтеротоксин от 65 до 90 мг. Контроли-нативный стерильный бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4) и гретый при 56^oC центрифугат 20-часовой бульонной культуры 30-35 мг соответственно.

Результаты приведены в таблице.

Пример 2. 0,1 мл 1 млрд. суспензии суточной агаровой культуры сеют в бульон Хоттингера (pH 7,2-7,4), инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 ч и 500 млн. м.т. суспензию в объеме 1 мл вводят в сегмент изолированной петли тонкого кишечника кролика. Через 16 ч животных умерщвляют воздушной эмболией и расчитывают отношение объема эксудата к длине сегмента (v/l). При этом 20-часовая бульонная культура штамма Rettgerella rettgeri ГИСК N 243 оказалась способной давать накопление жидкости в большом количестве и показатель v/l составил 1,3. У остальных 20 штаммов, способных продуцировать ЛТ-энтеротоксин, показатель v/l колебался в пределах от 0,9-1,0. При введении стерильного бульона Хоттингера и гретой при 100^oC 20-часовой бульонной культуры отношение объема накопленной жидкости и длине сегмента составило 0,25 и 0,3 соответственно.

Использование: биотехнология, штамм бактерий Rettgerella rettgeri, термолабильный энтеротоксин, ЛТ-энтеротоксин, анатоксин, вакцина. Сущность изобретения: штамм бактерий Rettgerella rettgeri 689 обладает повышенной токсинопродуцирующей способностью. Штамм депортирован в ГИСК и имеет регистрационный номер 243. Штамм может быть использован для получения термолабильного энтеротоксина и анатоксина при производстве вакцин. 1 табл.

Штамм бактерий Rettgerella rettgeri ГИСК N 243, обладающий комплексом факторов патогенности.