Способ получения гиалуроновой кислоты Российский патент 2023 года по МПК C08B37/08 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к биохимическому способу получения гиалуроновой кислоты, применяемой в медицине, косметологии и в ветеринарии.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты [Патент РФ № 2186786], включающий обескровливание петушиных гребней этиловым спиртом в соотношении 1:2, измельчение, водную экстракцию, отделение водной фракции, осаждение целевого продукта этиловым спиртом в соотношении 1: 3 с последующим фильтрованием и сушкой продукта, отличающийся тем, что на стадии водной экстракции проводят обработку сырья раствором ферментного препарата коллагеназы с содержанием 0,035-0,040% к массе сырья в течение 45-50 мин при температуре 45-50 °С и рН 6,8-7,0. Недостатком данного способа является низкий выход гиалуроновой кислоты и использование большого количества этанола и коллагеназы, имеющих высокую стоимость, что значительно удорожает конечный продукт.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты [Патент РФ № 2115662], включающий обескровливание, промывание водой и гомогенизацию сырья с его дальнейшим пятикратным замораживанием до -20- -70 °C и экстракцией водой 95-100 °C в течение 15 минут с последующим объединением экстрактов, осаждением гиалуроновой кислоты при добавлении уксусной кислоты и лиофильной сушкой. К недостаткам способа можно отнести отсутствие стадии удаления белков и, как следствие, получение гиалуроновой кислоты в комплексе с ними. Помимо этого довольно продолжительная инкубация гиалуроновой кислоты при температуре близкой к 100 °С приводит к необратимым изменениям её конформации и деполимеризации.

Выбранный в качестве наиболее близкого аналога-прототипа способ получения гиалуроновой кислоты [Патент РФ № 2102400] предусматривает экстракцию измельченных петушиных гребней и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что проводят двухстадийную экстракцию сырья физиологическим раствором при 80-90 °С, экстракты объединяют, гиалуроновую кислоту осаждают 1-2%-ным водным раствором уксусной кислоты, осадок заливают дистиллированной водой, подщелачивают раствором едкого натра, нагревают до 80-90 °С, полученный раствор фильтруют, фильтрат лиофилизируют. Авторы указывают, что намеренно исключают стадию отделения белка, поскольку гиалуроновая кислота в комплексе с белками обладает большей стабильностью. Это действительно так, но присутствие белков значительно повышает вероятность появления аллергий при использовании препарата, полученного этим способом, в косметологии. Кроме того, недостатком способа является невысокий выход гиалуроновой кислоты.

Таким образом, технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа выделения гиалуроновой кислоты, позволяющего добиться высокого выхода не деполимеризованной и свободной от белков гиалуроновой кислоты.

Для решения поставленной технической задачи предложен способ получения гиалуроновой кислоты, характеризующийся тем, что обескровленные и промытые водой петушиные гребни или пупочные канатики гомогенизируют, затем проводят экстракцию сырья физиологическим раствором в течение 15 мин при 80-90 °C и соотношении сырье:физиологический раствор 1:5, далее осадок отделяют фильтрованием или центрифугированиеми, замораживают до -20 - -40 °C и выдерживают в течение 5 часов, затем заливают физиологическим раствором при соотношении сырье:физиологический раствор 1:5, нагревают до 80-90 °C и выдерживают 15 мин при заданной температуре, осадок вновь отделяют фильтрованием или центрифугированием, надосадочную жидкость сохраняют, а с осадком еще три раза повторяют процедуру замораживания - экстракции горячим физиологическим раствором, полученную таким образом надосадочную жидкость объединяют, добавляют фосфатный буфер до pH 7 и гидролизуют белок, содержащийся в экстракте, трипсином 250 USP ед/мг в течение 2 ч при 37°C в количестве 0,03% к начальной массе петушиных гребней или пупочных канатиков, далее гиалуроновую кислоту, освобожденную от белков, осаждают 1-2 об.% водным раствором уксусной кислоты, выпавший осадок отделяют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут, затем осадок растворяют в дистиллированной воде при соотношении осадок:вода 1:2 и нейтрализуют раствором едкого натра до значения pH 7,0-7,3, подогревают до 80-90 °C и фильтруют, фильтрат замораживают и далее лиофилизируют.

Способ получения гиалуроновой кислоты осуществляется следующим образом.

Обескровленные петушиные гребни или пупочные канатики промывают проточной водой и гомогенизируют.

Затем проводят экстракцию полученного сырья физиологическим раствором в течение 15 мин при 80-90 °C при соотношении сырье:физиологический раствор 1:5.

Полученный осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием и замораживают до -20 - -40 °C с выдержкой при указанной температуре в течение 5 часов, а надосадочную жидкость (экстракт) сохраняют.

Затем осадок вновь заливают физиологическим раствором при соотношении сырье:физиологический раствор 1:5 и нагревают до 80-90 °C и выдерживают 15 мин при заданной температуре. Осадок вновь отделяют фильтрованием или центрифугированием, а надосадочную жидкость сохраняют. С осадком еще три раза повторяют процедуру замораживания - экстракции горячим физиологическим раствором, полученную таким образом надосадочную жидкость (экстракт) объединяют, добавляют фосфатный буфер до pH 7 и гидролизуют белок, содержащийся в экстракте, трипсином 250 USP ед/мг в течение 2 ч при 37°C в количестве 0,03% к начальной массе петушиных гребней или пупочных канатиков.

Далее гиалуроновую кислоту, освобожденную от белков, осаждают 1-2 об.% водным раствором уксусной кислоты, выпавший осадок отделяют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут, затем осадок растворяют в дистиллированной воде при соотношении осадок:вода 1:2 и нейтрализуют раствором едкого натра до значения pH 7,0-7,3, подогревают до 80-90 °C и фильтруют, фильтрат замораживают и далее лиофилизируют.

Осуществление способа получения гиалуроновой кислоты подтверждается следующими примерами.

Пример 1. В качестве сырья используют петушиные гребни, которые промывают от загрязнений холодной водой, затем водой с температурой 50 °C.

0,5 кг отмытых от крови петушиных гребней измельчают в гомогенизаторе, заливают 2,5 л физиологического раствора, перемешивают и нагревают до 90 °С, затем выдерживают при этой температуре в течение 15 минут при постоянном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, экстракт сохраняют, а осадок замораживают при -40 °С в течение 5 часов. Процедуру экстракции физиологическим раствором и замораживания повторяют еще 4 раза при тех же параметрах. Получившиеся в результате экстракты объединяют, доводят фосфатным буфером рН до 7, прибавляют 150 мг трипсина и выдерживают 2 ч при 37 °С. После чего добавляют 1%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 50 мл, оставляют до полного формирования осадка, надосадочную жидкость удаляют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут. Осадок заливают 1 л дистиллированной воды, тщательно перемешивают и раствором едкого натра доводят pH до значения 7,0, нагревают до 80 °C, фильтруют, фильтрат лиофилизируют.

Получают 28 г гиалуроновой кислоты, что составляет 5,6 % от массы исходного сырья.

Пример 2. В качестве сырья используют пупочные канатики, которые промывают от загрязнений холодной водой, затем водой с температурой 50 °C.

0,5 кг отмытых от крови канатикорв измельчают в гомогенизаторе, заливают 2,5 л физиологического раствора, перемешивают и нагревают до 90 °С, затем выдерживают при этой температуре в течение 15 минут при постоянном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, экстракт сохраняют, а осадок замораживают при -40 °С в течение 5 часов. Процедуру экстракции физиологическим раствором и замораживания повторяют еще 4 раза при тех же параметрах. Получившиеся в результате экстракты объединяют, доводят фосфатным буфером рН до 7, прибавляют 150 мг трипсина и выдерживают 2 ч при 37 °С. После чего добавляют 1%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 50 мл, оставляют до полного формирования осадка, надосадочную жидкость удаляют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут. Осадок заливают 1 л дистиллированной воды, тщательно перемешивают и раствором едкого натра доводят pH до значения 7,0 нагревают до 80 °C, фильтруют, фильтрат лиофилизируют.

Получают 25 г гиалуроновой кислоты, что составляет 5,0 % от массы исходного сырья.

В табл. 1 и 2 представлены характеристики заявляемого способа в сравнении с прототипом и полученной гиалуроновой кислоты.

Как видно из табл. 1, 2, получаемый по предлагаемому способу препарат не содержит белков, а его выход относительно исходной массы сырья увеличен, что говорит о большей экономической целесообразности и применимости конечного продукта в косметологии вследствие отсутствия белков-аллергенов, по сравнению с гиалуроновой кислотой, получаемой по способу-прототипу.

Таблица 1
Характеристики заявляемого способа в сравнении с прототипом Характеристики Известный способ (прототип) Предлагаемый способ Выход гиалуроновой кислоты, % к исходной массе сырья 3,5-4,8 5,0-5,6 Содержание белка, % 0,4-0,5 не более 0,05 Содержание нуклеиновых кислот, мкг/мл следы следы Содержание основного вещества не менее 90 не менее 94

Таблица 2
Характеристика гиалуроновой кислоты, получаемой предлагаемым способом Наименование показателя Значение показателя Внешний вид Сублимированный порошок Цвет Светло-кремовый Растворимость Растворяется в воде при нагревании не менее 60 °С Содержание основного вещества, % не менее 94 рН 0,5% водного раствора при 20-25 °С 7,0±0,2 Массовая доля влаги, % не более 6 Токсичность не токсичен Содержание белка, % не более 0,05 Содержание нуклеиновых кислот, мкг/мл следы

Осуществление предлагаемого способа позволяет увеличить выход гиалуроновой до 5,6% к исходной массе сырья и получить препарат не деполимеризованной и свободной от белков гиалуроновой кислоты, с содержанием целевого вещества не менее 94%.

Изобретение относится к способу получения гиалуроновой кислоты, применяемой в медицине, косметологии и в ветеринарии. Предложен способ получения гиалуроновой кислоты. Обескровленные и промытые водой петушиные гребни или пупочные канатики гомогенизируют, затем проводят экстракцию сырья физиологическим раствором в течение 15 мин при 80-90°C и соотношении сырье:физиологический раствор 1:5. Далее осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием, замораживают до -20-(-40)°C и выдерживают в течение 5 часов. Затем заливают физиологическим раствором при соотношении сырье:физиологический раствор 1:5, нагревают до 80-90°C и выдерживают 15 мин при заданной температуре, осадок вновь отделяют фильтрованием или центрифугированием, надосадочную жидкость сохраняют. С осадком еще три раза повторяют процедуру замораживания - экстракции горячим физиологическим раствором. Полученную таким образом надосадочную жидкость объединяют, добавляют фосфатный буфер до pH 7 и гидролизуют белок, содержащийся в экстракте, трипсином 250 USP ед./мг в течение 2 ч при 37°C в количестве 0,03% к начальной массе петушиных гребней или пупочных канатиков. Далее гиалуроновую кислоту, освобожденную от белков, осаждают 1-2 об.% водным раствором уксусной кислоты, выпавший осадок отделяют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут, затем осадок растворяют в дистиллированной воде при соотношении осадок:вода 1:2 и нейтрализуют раствором едкого натра до значения pH 7,0-7,3, подогревают до 80-90°C и фильтруют, фильтрат замораживают и далее лиофилизируют. Изобретение позволяет увеличить выход гиалуроновой кислоты до 5,6% к исходной массе сырья и получить препарат недеполимеризованной и свободной от белков гиалуроновой кислоты с содержанием целевого вещества не менее 94%. 2 табл., 2 пр.

Способ получения гиалуроновой кислоты, характеризующийся тем, что обескровленные и промытые водой петушиные гребни или пупочные канатики гомогенизируют, затем проводят экстракцию сырья физиологическим раствором в течение 15 мин при 80-90°C и соотношении сырье:физиологический раствор 1:5, далее осадок отделяют фильтрованием или центрифугированиеми, замораживают до -20–(-40)°C и выдерживают в течение 5 часов, затем заливают физиологическим раствором при соотношении сырье:физиологический раствор 1:5, нагревают до 80-90°C и выдерживают 15 мин при заданной температуре, осадок вновь отделяют фильтрованием или центрифугированием, надосадочную жидкость сохраняют, а с осадком еще три раза повторяют процедуру замораживания - экстракции горячим физиологическим раствором, полученную таким образом надосадочную жидкость объединяют, добавляют фосфатный буфер до pH 7 и гидролизуют белок, содержащийся в экстракте, трипсином 250 USP ед./мг в течение 2 ч при 37°C в количестве 0,03% к начальной массе петушиных гребней или пупочных канатиков, далее гиалуроновую кислоту, освобожденную от белков, осаждают 1-2 об.% водным раствором уксусной кислоты, выпавший осадок отделяют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут, затем осадок растворяют в дистиллированной воде при соотношении осадок:вода 1:2 и нейтрализуют раствором едкого натра до значения pH 7,0-7,3, подогревают до 80-90°C и фильтруют, фильтрат замораживают и далее лиофилизируют.