СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИЦЕРОЛОКСИДАЗЫ Российский патент 1998 года по МПК C12N9/04 C12N9/04 C12R1/645 

Изобретение относится к области медицинской биохимии, а именно к области клинико-диагностических исследований для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний, основанных на способности получаемого с помощью заявляемого способа фермента - глицеролоксидазы, окислять глицерин кислородом воздуха с образованием глицеральдегида и перекиси водорода. Это обеспечивает возможность определения триглицеридов, являющихся одним из основных компонентов липопротеидных комплексов крови, с помощью следующей последовательности реакций:

Известны способы получения глицеролоксидазы с использованием в качестве продуцентов фермента микроорганизмов, относящихся к родам мицелиальных грибов Penicillium, Aspergillus и Nerospora [1 - 5]. Все известные способы получения глицеролоксидазы с использованием указанных микроорганизмов продуцентов равноценны по отношению к предлагаемому способу и любой из них может быть принят за прототип. Однако наиболее подробное описание способа приведено в [5], что позволяет использовать данную работу в качестве прототипа.

В работе дается описание способа получения глицеролоксидазы путем культивирования продуцентов фермента, относящихся к мицелиальным грибам, включая получение посевного материала и дальнейшего выращивания биомассы на питательной среде, содержащей глицерин в качестве единственного источника углерода, разрушения клеток биомассы, очистку фермента.

В рассматриваемом прототипе были исследованы 2400 микроорганизмов, относящихся к разным таксономическим группам, включая 1800 мицелиальных грибов. Выделение новых штаммов микроорганизмов в данной работе проводили из накопительных культур, получаемых при культивировании образцов почв на среде, содержащей глицерин в качестве единственного источника углерода (см. состав среды N1). Затем накопительные культуры рассевали на агаризованной среде и отдельные колонии высевали в жидкую среду N1, культивировали 1-2 суток при 30^oC, клетки собирали центрифугированием или фильтрацией, промывали дистиллированной водой, ресуспендировали в карбонат-боратном буфере (pH 10,0) и разрушали с помощью дезинтегратора Балатини. Активность глицеролоксидазы определяли при 37^oC в системе, содержащей в расчете на 3 мл буфера пероксидазу - 100 ед, глицерин - 50 мкмоль, 1,2 мкмоль аминоантипирина и 21 мкмоль фенола. С использованием данной схемы из 2400 исследованных микроорганизмов, включая 1800 мицелиальных грибов, было выделено 11 штаммов, относящихся к родам Aspergillus, Neurospora и Penicillium. Максимальной активностью обладал штамм Aspergillus japonicum - 1,12 ед на 1 мл среды.

С целью получения фермента указанную выше культуру выращивали на среде с глицерином в качестве единственного источника углерода и пересевали в ферментер с объемом среды 15 л. Очистку фермента проводили разрушением клеток в боратном буфере при pH 10, центрифугированием гомогената (10 000g • 20 мин), фракционированием сульфатом аммония (40 - 70% от насыщения) и последующей хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе, гидроксилапатите и сефадексе Г 200. Выход фермента по активности составил 35%, при конечной активности препаратов 142 ед на 1 мг белка.

Общим недостатком известных способов получения глицеролоксидазы, что хорошо видно из способа прототипа, где в качестве продуцентов исследовалось 2400 штаммов микроорганизмов из разных таксономических групп, является крайне низкая вероятность обнаружения штаммов, способных синтезировать данный фермент, а следовательно, и низкая вероятность обнаружения высокоактивных продуцентов. Поэтому весьма актуальна разработка способа получения глицеролоксидазы на основе использования более эффективных микроорганизмов продуцентов.

Авторами заявляемого изобретения, во-первых, было обнаружено, что мицелиальные грибы, относящиеся к роду Botrytis, виду allii отличаются высокой способностью к образованию глицеролоксидазы. Причем выделение продуцентов из вида B. allii с глицеролоксидазной активностью может быть проведено с помощью простой методики.

Во-вторых, использование условий культивирования, в наибольшей степени учитывающих физиологические особенности B. allii, позволяет значительно увеличить уровень синтеза глицеролоксидазы.

Нами предложен способ получения глицеролоксидазы, существенным отличием которого от известных ранее является использование в качестве продуцентов фермента мицелиальных грибов, относящихся к виду Botritis allii, выращивание биомассы которых проводится в две стадии с использованием двух типов сред. На первой стадии культуры выращивались на среде, содержащей в качестве основного компонента травяной отвар, после чего пересевались на среду с глицерином в качестве единственного источника углерода.

Приводимый ниже пример 1 демонстрирует возможность выделения высокоактивных штаммов продуцентов с помощью простой методики практически со 100% частотой, пример 2 - увеличение уровня синтеза глицеролоксидазы за счет предлагаемого способа культивирования продуцентов и пример 3 - возможности выделения глицеролоксидазы из предлагаемых продуцентов.

Пример 1. Выделение продуцентов глицеролоксидазы, относящихся к виду B. allii. Для выделения использовали образцы загнивающего лука или лука, имеющего серо-черный налет, выращенного в Подмосковье и разных регионах стран СНГ. Соскобы с луковиц диспергировали в стерильной воде и высевали на сусло-агар для получения отдельных колоний. При необходимости после первого пассажа проводили повторный рассев для получения отдельных колоний. Полученные культуры поддерживали на сусло-агаре. Для выявления активности глицеролоксидазы культуры с твердой среды пересевали в качалочные колбы, содержащие 400 мл среды, являющейся стандартной для выращивания продуцентов глицеролоксидазы (среда N1), следующего состава, г/л водопроводной воды; глицерин - 3, NaNO₃ - 0,30; KH₂PO₄ - 0,10; KCl - 0,05; MgSO₄ - 0,05; FeSO₄ - 0,01; сусло - 0,2, начальное значение pH 6,0. Культуры выращивали на качалке при 28 - 30^oC в течение 3-4 суток. Мицелий отделяли фильтрованием, замораживали в жидком азоте и разрушали на прессе при избыточном давлении 3 000 атм, полученный гомогенат центрифугировали и определяли активность в надосадочной жидкости по методике, описанной в прототипе.

При использовании данной схемы из 19 выделенных микроорганизмов все обладали глицеролоксидазной активностью, величины которой составляли для разных культур от 0,200 до 1,3 на 1 мл среды. Таким образом, предлагаемая схема позволила проводить отбор продуцентов глицеролоксидазы практически со 100% вероятностью.

Активности выделенных штаммов B.allis при известных ранее условиях выращивания продуцентов глицеролоксидазы приблизительно соответствовали активностям, наблюдаемым для наиболее эффективных продуцентов известных ранее. Однако использование условий культивирования в наибольшей степени учитывающих физиологические особенности грибов рода Botrytis, позволяет значительно увеличить уровень синтеза глицеролоксидазы.

Пример 2. Культуры высевали с твердой среды (сусло-агар) в качалочные колбы с общим объемом 750 мл, содержащие 400 мл среды на основе травяного отвара (среда N2). Последняя готовится автоклавированием сена (50 г/л водопроводной воды), фильтрованием и добавлением в отвар минеральных солей, входящих в состав среды N1. После 24 часов выращивания на среде N2 20 - 40 мл культуры пересевали в качалочные колбы с 400 мл среды N1. Через 24 - 48 часов собирали мицелий и анализировали активности, как это описано в примере 1. В таблице представлены данные, полученные при культивировании штаммов B. alli.

Использование предлагаемой схемы культивирования приводит к увеличению синтеза глицеролоксидазы в 5 - 12 раз по сравнению с результатами, полученными при использовании известной схемы.

Пример 3. Описание получения частично очищенных препаратов глицеролоксидазы. B. allii штамм N4 высевали с сусло-агара в колбы со средой N2 (5 колб, содержащих по 200 мл среды). После 18 часов выращивания на качалке посевной материал вносили в ферментер (среда N 1, 10 л) и культивировали 36 часов. Мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрацией, замораживали и разрушали на Х-прессе. Полученный гомогенат центрифугировали (18,000 g, 20 мин), надосадочную жидкость охлаждали до 0^oC, добавляли ацетон, предварительно охлажденный до - 20^oC из расчета 1 объем ацетона на 1 объем надосадочной жидкости. Образующийся осадок собирали центрифугированием, ресуспендировали, в 0,01 М трис-HCl буфере и снова центрифугировали. Супернатант наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозу, промывали колонку и элюировали фермент 0,2 М раствором хлористого натрия в том же буфере. Удельная активность препаратов составляла 115 ед/мг белка, выход по активности при проведении очистки - 65%.

Литература
1. Патент США N 4202941.

2. Патент США N 4255519.

3. Патент Англии 2025979, C 12 N 9/04, 80.

4. Европейский патент N 0033540, C 12 N 9/04, 1981.

5. Uwajima T. , Akita H. , Ito K., Mihara A., Aisaka K., Terada O., "Formation and Purifacation of Gliceroloxidase", Agricultiral and Biologicol Chemistry", 1980, v. 44, N 2, pp. 399 - 406а

Использование: биотехнология, медицинская биохимия для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний. Сущность изобретения: способ предусматривает получение глицеролоксидазы (глицерол O₂ оксидоредуктаза), катализирующей окисление глицерина кислородом воздуха с образованием глицеральдегида и перекиси водорода и применяющейся в сочетании с липазой и пероксидазой для определения триглицеридов, использование новых продуцентов фермента - штаммов мицелиальных грибов Botrytis allii, а также использование схемы получения биомассы, включающей выращивание посевного материала на среде, основным компонентом которой является сенной отвар, и культивированием на среде с глицерином в качестве единственного углеродного субстрата. 1 табл.

Способ получения глицеролоксидазы, предусматривающий приготовление посевного материала продуцента - мицелиального гриба, культивирование его на питательной среде, содержащий глицерин в качестве единственного источника углерода, разрушение клеток и очистку фермента, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм гриба Botrytis fllii.