СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ, СЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ К ВАКЦИНЕ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 

Настоящее изобретение относится к области ветеринарии, в частности для оценки контроля иммуногенности вакцины против болезни Марека (БМ).

Существуют методы определения сенсибилизированных лимфоцитов, такие, как иммунофлюоресценция, адсорбция лимфоцитов на антигенсодержащих колонках, непрямое розеткообразование, однако они разработаны для других инфекций, требуют специального оборудования и дефицитных реактивов.

Известен способ получения спонтанных розеток к лимфоцитам кур. Но этот способ характеризует иммунный ответ совокупности лимфоцитов, способных образовывать спонтанное связывание с этитроцитами барана. Контролирует иммунное розеткообразование только тех лимфоцитов, активность которых обусловлена введением вакцины против БМ. Предлагаемый способ дает специфическую характеристику качества вакцины против БМ, характеризуя вызываемый ею клеточный ответ, и анализирует ее иммунногенность.

Целью настоящего изобретения является способ получения иммунных розеток для учета сенсибилизированных лимфоцитов в результате введения вакцины против БМ.

Поставленная цель достигается тем, что эритроциты барана нагружаются антигеном, клеточно-свободной вакциной вируса герпеса индеек (ВГИ). Нативные эритроциты трижды промывают от среды Олсвера и готовят их 5% рабочее разведение в 0,15М растворе хлорида натрия (NaCl). Клеточно-свободную вакцину ВГИ, разведенную в 2 мл 0,15М раствора хлористого натрия, диализуют от фосфатных солей 18 ч при t = 4^oC в физиологическом растворе. Соединяют 1 мл 5%-ной суспензии эритроцитов барана и 1 мл разбавленного в 10 раз отдиализованного вируса на 30 мин при t = 230^oC. К смеси добавляют 0,1 мл 0,1% раствора треххлористого хрома на 5-6 мин, затем, чтобы остановить действие хрома, добавляют среду 199 и промывают трижды в 0,15М NaCl. Полученные таким образом эритроциты барана ставят в холодильник в среде 199 с добавлением сыворотки КРС и 2% глюкозы. Через сутки кровь от вакцинированных против БМ кур берут в орошенную гепарином пробирку до 2 мл, наслаивают на фиколверографин ρ 1,082 в соотношении 1:1 и центрифугируют при 350g в течение 40 мин. Лимфоциты отбирают из интерфазы и трижды отмывают средой 199, доводят их концентрацию до 2•10⁶ кл/мл. Суспензию эритроцитов барана отмывают в среде 199 и доводят концентрацию до 1%. Соединяют 0,1 мл лимфоцитов с 0,1 мл сенсибилизированных эритроцитов барана и оставляют на 20 мин при t = 37^oC, затем центрифугируют 3 мин при 350g, помещают на 2 ч в холодильник при t = 4^oC, добавляют 50 мкл глютарового альдегида (0,6%) на 16 ч. После этого осторожно по стенке наливают 2 мл воды, тут же отсасывают пипеткой 2,1 мл жидкости. Осадок осторожно ресуспензируют и делают мазки на предметном стекле. После высыхания мазок фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза.

Пример 1. Вводили суточным цыплятам вакцину ВГИ в разных дозах (200 и 2000) фокусообразующих единиц. На седьмой день измеряли уровень иммунного розеткообразования (И-РОК). Метод позволил регистрировать достоверные различия между группами, получившими вакцину с разными дозами разведения: 14,0±1,3% и 16,3±0,8% соответственно при фоновом (в невакционированной группе) И-РОК 8,2±2,1%.

Пример 2. Измеряли уровень розеткообразующих клеток в сравнении двух методик: прототипа - спонтанного розеткообразования и предлагаемого метода - иммунного розеткообразования. На седьмой день в вакцинированной группе И-РОК в 16,3±0,8 оказалось ниже спонтанного уровня Е-РОК 23,0±1,4%. К десятому дню эти показатели сравнялись, а на 16-й день после введения вакцины процент И-РОК составил 22,1±1,0% против 18,0±0,8% спонтанных розеток.

Приведенные примеры свидетельствуют о том, что каждый из методов характеризует специфический развивающийся процесс, в котором участвуют различные популяции лимфоцитов.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности для прижизненного контроля на наличие патологического процесса при племенном разведении птиц, характерного для болезни Марека (БМ). Цель изобретения - получение иммунных розеток для учета сенсибилизированных лимфоцитов в результате введения вакцины против БМ. Для этого этритроциты барана нагружаются антигеном клеточно-свободной вакцины вируса герпеса индеек.

Способ определения лимфоцитов, сенсибилизированных к вакцине против болезни Марека, включающий использование реакции розеткообразования эритроцитов барана с лимфоцитами вакцинированной герпес вирусом птицы, которые выделены в градиенте плотности фикол-верографин и выявление в полученных розетках этих лимфоцитов, отличающийся тем, что эритроциты барана предварительно нагружают антигеном клеточносвободной вакцины вируса герпеса индеек, а для реакции с ними берут лимфоциты вакцинированной вирусом болезни Марека птицы.