ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК C07K5/37 A61K38/05 

Изобретение относится к медицине, а именно к новым пептидным структурам, обладающим иммуномодулирующими свойствами.

Известно применение в медицине большого количества иммуностимуляторов, таких как препараты женьшеня и лимонника, производные никотиновой кислоты, тималин и т.д. (Машковский М.Д. Лекарственные средства, т. 11, М. Медицина, 1988, с. 169).

Недостатком большинства природных препаратов является невысокая активность в связи с низким содержанием активного начала, наличие подобных эффектов.

Известно значительное количество иммуностимуляторов пептидной природы, например, тактивин (патент Франции N 2570278б, кл. A 61 K 39/41), тимозин (Goldstein A. L. et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1972, v. 69, p. 1856-1863), полученных из природного сырья. Эти препараты представляют собой набор полипептидов различной длины, воздействующих на различные звенья иммунного ответа, а также на ряд других физиологических функций организма, что ведет к появлению нежелательных побочных эффектов. Кроме того, практическое использование таких препаратов затруднено в связи со сложностью способов их извлечения из природного сырья, малым выходом, значительной вариабельностью их физико-химических свойств.

Поиск синтетических пептидов с селективной активностью на счет изменений структуры представляется более целесообразным. Синтетическими пептидными иммуностимуляторами являются пептид Glu-Asp-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asp-OH (патент США N 4478828, кл. A 61 K 37/00, C 07 C 103/52, 1984), аналоги тимопентина (Европейский патент, кл. C 07 K 7/64, 1985, патент США N 5013723, кл. A 61 K 37/02, 1991) и т.п.

Еще больше интерес представляет создание пептидных иммуностимуляторов на основе коротких, селективно действующих высоко активных пептидов, синтез которых является экономически выгодным.

Прототипом заявляемого изобретения являлся пептид H-α-L-Glu-L-Trp-OH, недостатком которого является менее высокая иммуномодулирующая активность.

Задачей, стоящей перед авторами при создании настоящего изобретения, являлось разработка более эффективных и безопасных иммуномодуляторов на основе коротких пептидов.

Было найдено, что данная задача решается путем использования хотя бы одного из пептидов общей формулы:

где R H, низший ацил или низший алкил,
X ароматическая или гетероароматическая аминокислота или ее производное, например эфир, амид, гидразид и т.д.

Пептиды получают стандартной технологией пептидного синтеза на твердой фазе (J. M. Steward and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co. San Francisco, 1969), или путем синтеза в растворе (E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965) с последующим отщеплением защитных групп и очисткой конечного продукта.

В качестве промежуточной защиты α-аминогруппы аминокислот при твердофазном методе синтеза используют трет-бутилоксикарбонильную группу. Для защиты боковых радикалов аминокислот используют следующие группы: для гистидина бензилоксиметильную; тирозина 2,6-дихлорбензильную; для триптофана формильную и т. д. Для конденсации используют дициклогексилкарбодиимид или дициклогексилкарбодиимид с добавкой 1-гидроксибензотриазола. Деблокирование ведут 50% -ным раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, а нейтрализацию 5%-ным раствором диизопропилэтиламина в хлористом метилене.

Отщепление полученных пептидов от полимера и деблокирование боковых защитных групп ведут с помощью безводного фтористого водорода, а очистку - гель- и обращеннофазовой хроматографией.

Пример 1. Синтез пептида g-L-глутамил-L-триптофана (1)
0,6 г (0,0018 моль) a-бензилового эфира N-трет.-бутилоксикарбонил-L-глутаминовой кислоты растворяют в 2,0 см³ диметилформамида, добавляют 0,2 г (0,0018 моль) N-оксисукцинимида, охлаждают до минус 5^oC и при сильном перемешивании приливают к реакционной смеси раствор 0,37 г (0,0018 моль) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 2,0 см³ диметилформамида. Смесь перемешивают при 0^oC 1 ч и оставляют на 12 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают дициклогексилмочевину, прибавляют к фильтрату 0,72 г (0,0022 моль) гидрохлорида бензилового эфира L-триптофана и 0,3 см³ (0,0023 моль) триэтиламина и перемешивают реакционную смесь 16 ч при комнатной температуре. Раствор фильтруют, разбавляют 50,0 см³ воды и экстрагируют три раза 40 см³ этилацетата. Объединенные органические экстракты промывают последовательно 20,0 см³ воды, два раза по 20,0 см³ 2 н серной кислоты, два раза по 20,0 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и сушат безводным сернокислым натрием.

Упаривают полученный органический раствор при пониженном давлении, остаток обрабатывают 16,0 см³ 50%-ного раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене в течение 45 мин, снова упаривают при пониженном давлении и прибавляют 25,0 см³ изопропилового спирта.

К полученному раствору 0,3 г (0,00048 моль) фторацетата дибензилового эфира g-дипептида прибавляют 0,16 г (0,00096 моль) кислого углекислого натрия и 0,18 г (0,0024 моль) формиата аммония. Реакционную смесь нагревают до 50^oC, прибавляют небольшими порциями 5,0 г 10% палладия на угле, суспензированного в 25,0 см³ воды, и перемешивают в течение 30 мин. Отфильтровывают катализатор, упаривают изопропиловый спирт при пониженном давлении, водный раствор лиофилизуют, прибавляют к остатку 20,0 см³ воды и снова лиофилизуют.

Полученный лиофилизат очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте (10-30%) ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Содержание основного вещества по данным оптической плотности не менее 97% Структура подтверждается данными аминокислотного анализа гидролизата пептида, полученного в результате гидролиза в 3 н паратолуолсульфокислоте. Анализ выявил следующее соотношение аминокислотных остатков: Glu 1,0(1); Trp 0,9(1).

Пример 2. Синтез пептида g-L-глутамил-N_in-формил-L-триптофана (II)
Для синтеза пептида g-L-глутамил-N_in-формил-L-триптофана загружают в реакционный сосуд 0,6 г трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофил-полимера. Содержание триптофана 0,50 ммоль/г полимера. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (см. табл.1).

Если нингидриновый тест положителен, повторяют конденсацию, начиная с п. 5.

Для синтеза пептида в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют a-бензиловый эфир N-карбобензокси-L-глутаминовой кислоты.

По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. 1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 1 мл тиоанизола и 1 мл мета-крезола, охлаждают до температуры -78^oC и в течение 10 мин перегоняют 10 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0^oC и перемешивают в течение 60 мин, затем отгоняют фтористый водород. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизируют.

После обессоливания на колонке с Sephadex G-10 полученный лиофилизат очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте (10-30%) ацетонитрила в 0,1% трифтроуксусной кислоте. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 96% Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 3. Синтез пептида g-L-глутамил-b-тиенил-D-аланил-амида (III).

Синтез, блокирование, очистка и характеристика пептида осуществляются теми же способами, что и пептида примера 2, за исключением того, что реакционный сосуд загружают 0,6 г третбутилоксикарбонил-b-тиенил-D-аланил-бензгидриламинополимера и выдерживают реакционную смесь при деблокировании в среде безводного фтористого водорода в течение 2 ч. Содержание b-тиенил-D-аланина 0,5 ммоль/г полимера.

Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 97%
Пример 4. Синтез пептида N-метил-g-L-глутамил-L-триптофана (IV).

Синтез пептида (IV) осуществляется теми же способами, что и пептида (II) из примера 2, за исключением того, что на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют a-бензиловый эфир N-третбутилоксикарбонил N-метил-L-глютаминовой кислоты.

По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. 1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 6,5 мл диметилсульфида, 0,8 мл мета-крезола и 0,4 мл этандитиола, охлаждают до температуры -78^oC и в течение 10 мин перегоняют 2,5 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0^oC и перемешивают в течение 120 мин, затем отгоняют фтористый водород и диметилсульфид. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизируют.

После обессоливания на колонке с Sephadex G-10 полученный лиофилизат очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте (10-30%) ацетонитрила в 0,1% трифтроуксусной кислоте. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 97% Строение вещества доказывалось условиями синтеза и аминокислотным составом. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 5. Синтез пептида N-ацетил- g-L-глутамил-L-триптофана (V).

Синтез пептида (IV) осуществляется теми же способами, что и пептида (II) из примера 2, за исключением того, на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют a-бензиловый эфир N-третбутилоксикарбонил L-глютаминовой кислоты. Дипептидил-полимер обрабатывают 50% трифторуксусной кислотой в хлористом метилене (2 раза, 2 и 30 мин), промывают хлористым метиленом (4 раза, по 2 мин) и инкубируют в смеси, содержащей 0,11 мл триэтиламина, 0,28 мл уксусного ангидрида и 5 мл хлористого метилена.

По завершении пептидил-полимер промывают хлористым метиленом (6 раз по 2 мин), высушивают в вакууме, деблокируют и очищают, как показано в примере 4 (пептид IV). Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 96% Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Иммуномодулирующая активность заявляемых пептидов оценивалась в тестах их влияния на уровень экспрессии маркера дифференцировки T-лимфоцитов q-антигена и по их влиянию на индукцию синтеза главного ростового фактора T-лимфоцитов-интерлейкина-2.

Пример 6. Влияние пептидов на дифференцировку предшественников Т-лимфоцитов костного мозга мышей.

Взвесь клеток костного мозга мышей, умерщвленных дислокацией швейных позвонков, получают путем промывания бедренных костей физиологическим раствором. Пептиды в различных концентрациях добавляют к полученным клеткам в среде Игла и инкубируют в течение часа при 37^oC. Уровень экспрессии маркера дифференцировки Т-лимфоцитов q-антигена определяют методом комплементзависимого цитолиза с помощью антител к q-антигену (Terasabi P.I. et al. in Manual of Tissue Typing Techniques, Nathional Institute of Health, Bethesda, 1972, p. 50-55). Данные приведены в табл.2.

Пример 7. Влияние пептидов на продукцию интерлейкина-2 мышиными спленоцитами.

Данные по влиянию пептидов на индукцию синтеза главного ростового фактора Т-лимфоцитов-интерлейкина-2 (Gillis S. et. al. J. Immunol. 1978, v. 120, p. 2027-2032) приведены в табл. 3.

Препараты не токсичны, так как при 1000-кратном превышении терапевтической дозы (1 мг/кг) летальный исход не был обнаружен ни у одного животного.

Изобретение относится к медицине, а именно к соединениям, обладающим иммуномодулирующими свойствами. В качестве иммуномодулятора предлагается пептид структуры

где R - H, низший ацил или низший алкил, а X - ароматическая или гетероароматическая аминокислота или ее производное. 3 табл.

Пептид общей формулы

где R Н, низший ацил или низший алкил;
а Х ароматическая или гетероароматическая аминокислота или ее производное,
обладающий иммуномодулирующей активностью.