СПОСОБ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПОЛНОТЫ ИНАКТИВАЦИИ УБИТЫХ ВАКЦИН ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В КАЧЕСТВЕ ИНАКТИВАТОРА СЕРНОКИСЛОЙ МЕДИ Российский патент 1997 года по МПК G01N27/26 C12Q1/22 C12Q1/68 C12N7/06 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к применению метода электрофоретического анализа для технологического контроля полноты инактивации убитых вакцин при использовании в качестве инактиватора сернокислой меди и предназначен для использования при производстве убитых вакцин в биологической промышленности и ветеринарии.

Для контроля полноты инактивации (отсутствие живого вируса) убитых вакцин в настоящее время используют чувствительных животных или культуру клеток, а также комбинированный метод контроля в культуре клеток и на животных (Сергеев В.А. Киев: Урожай, 1993, с. 189-193), что сопряжено с дороговизной животных, трудоемкостью и длительностью (25-30 дней) выявления живого вируса путем многократного (не менее 5 пассажей) пассирования в культуре клеток.

Для изучения структурно-функциональной организации генома различных вирусов, в частности, вирусов ИРТ КРС и болезни Ауески, используется метод электофоретического анализа рестрикционных фрагментов ДНК (J.Gen.Virology 1985, 66, 27 87-27 92; Bruce S.Sial etal. Vet.microbiology 1990, 23, 85-1016), Van.Oischert et al.

Однако в доступной литературе сведения по применению указанного метода для оценки качества инактивированных вакцин на отсутствие живого вируса в препаратах отсутствуют.

Задачей изобретения является применение биофизического метода (электрофоретического анализа) для контроля полноты инактивации ДНК-содержащих вирусов в убитых вакцинах при использовании в качестве инактиватора сернокислой меди.

Поставленная задача достигается тем, что после обработки вирусов ИРТ КРС, АЧС и болезни Ауески сернокислой медью разрушается нуклеиновая кислота (НК) до низкомолекулярных фрагментов, не обладающих инфекционностью. Это позволяет с помощью указанного биофизического метода в течение 2-4 дней определить полноту инактивации в убитых вакцинах против этих болезней и служит тест-системой технологического контроля качества вакционных препаратов по этому показателю.

Пример конкретного выполнения.

В работе использовали штаммы: ТК-А вируса ИРТ КРС, "Бук" и "МК-25" вируса болезни Ауески, ФК-135 вируса АЧС, перевиваемые культуры клеток МДВК, ПСГК и ППК-66б. Инактиваторами вирусов служили теотропины (1, 8, 3, 6 диэндометилен 1, 3, 6, 8 тетраазациклодекан), сернокислая медь, димер этиленимина и формальдегид в конечной концентрации 0,05-0,2%
Пробы вирусов отбирали по 100 мл, ежедневно периодически перемешивали и выдерживали при 36-38^oC в течение 24-144 ч. После инактивации пробы антигенсодержащих материалов вирусов ИРТ КПС, болезни Ауески и АЧС проверяли на полноту инактивации с использованием общепринятого метода на культуру клеток и предлагаемого известного биофизического метода электрофоретического анализа.

При использовании предложенного способа проверки полноты инактивации вирусных препаратов проводят осветление антигенсодержащей вирусной суспензии центрифугированием при 2500 об/мин в течение 15-20 мин, вирусные частицы осаждают из надосадочной жидкости центрифугированием при 26000 об/мин в течение 1,5-2 ч и ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере. Затем указанную суспензию наносят на градиент тартрата калия (30-50%) и центрифугируют в течение 2-2,5 ч. Из фракции, содержащей полноценные и дефектные вирусные частицы, выделяют геномную ДНК фенольно-детергентным методом и оценивают целостность нуклеиновой кислоты методом электрофоретического анализа. Часть выделенной ДНК расщепляют рестриктазой Bam HI и размеры исходной расщепленной ДНК определяют электрофорезом в 0,7-2% геле агарозы в присутствии маркеров (ДНК фага лямда, разрезанная рестриктазой Hind III и окрашивают раствором этидиум бромида. В инактивированных препаратах (вирусов ИРТ КРС, болезни Ауески и АЧС) полностью отсутствуют фрагменты размерами более 50-100 нуклеотидов, при расщеплении рестриктазой Bam HI. На основании отсутствия в препаратах полноразмерной ДНК вируса судят о полной инактивации его в биоматериале.

Результаты действия различных инактиваторов на ДНК вирусов ИРТ КРС, болезни Ауески и АЧС представлены в табл. 1.

При использовании инактиваторов указанных в табл. 1 установлена их различная степень действия на НК вирусов ИРТ КРС, б. Ауески и АЧС. Из всех инактиваторов лишь сернокислая медь обеспечивала полное разрушение НК вирусов. При этом во всех фракциях после градиента тартрата калия при электрофорезе отсутствуют высокомолекулярные фрагменты НК, пул составляют низкомолекулярные фрагменты размерами 50-100 нуклеотидов. При расщеплении этих препаратов рестриктазой Bam HI не образуется характерный набор фрагментов вирусной НК, соответствующей конкретной пробе. Отсутствие полноразмерной геномной НК в инактивированных сернокислой медью вирусных антигенах служит основанием для использования экспрессной тест-системы на полную инактивацию ее в вакцинных препаратах.

При использовании других инактиваторов, представленных в табл. 1, вирусная НК практически не разрушается и основной пул ее составляют высокомолекулярные фрагменты, свидетельствующие об иных механизмах инактивации, которые не поддаются тестированию данным методом из-за целостности структуры НК и таким образом они не могут быть использованы для контроля полноты инактивации убитых вакцин, изготовленных из герпес- и иридовирусов.

Таким образом метод электофоретического анализа целостности вирусной ДНК с целью определения полноты ее инактивации можно использовать только для препаратов, инактивированных сернокислой медью. Сравнительная оценка технологического контроля полноты инактивации убитых вирусных препаратов разными методами представлена в табл. 2.

Как видно из табл. 2, при использовании животных или культуры клеток требуется 10-18 и 25-30 дней, соответственно, для контроля полноты инактивации вирусных препаратов, тогда как применение с этой целью биофизического метода позволяет провести эти исследования в течение 2-4 дней, что сокращает в 5-10 раз сроки проверки качества препаратов по этому показателю.

Таким образом применение биофизического (электрофоретического анализа) метода для технологического контроля полноты инактивации при изготовлении убитых вакцин является перспективным и может быть применимо в промышленном производстве герпес- и иридовирусных препаратов.

Предлагаемый метод контроля позволяет в течение минимального времени (2-4 дня) выявить технологический брак неинактивированные сернокислой медью образцы вакцины, тем самым, избежать появления брака и дальнейших расходов на обработку непригодного к использованию полуфабриката вакцины.

Использование: ветеринарная вирусология, в частности, при контроле полноты инактивации убитых вакцин. Сущность изобретения: после обработки вирусов ИРТ КРС, АЧС и болезни Ауески сернокислой медью разрушается нуклеиновая кислота до низкомолекулярных фрагментов, не обладающих инфекционностью, что позволяет с помощью электрофоретического анализа в течение 2-4 дней определить полноту инактивации убитых вакцин против этих болезней. 2 табл.

Применение метода электрофоретического анализа в качестве способа технологического контроля полноты инактивации убитых вакцин при использовании инактиватора сернокислой меди.