СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА Российский патент 1998 года по МПК A61K31/715 A61K9/16 A61K31/715 A61K38/17 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения лиофилизованного препарата альфа-фетопротеина (АФП), относящегося к группе иммуномодуляторов и используемого в качестве средства для лечения онкологических заболеваний.

АФП - представляет собой фетальный гликопротеид мол. массой около 70000 Да. В большом количестве АФП продуцируется клетками печени и брюшной стенки плода. Сырьем для получения АФП служит абортивная кровь, получаемая при мед. абортах от клинически здоровых женщин, прошедших стандартное обследование. Полученный абортивный материал обязательно тестируется на отсутствие антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и на отсутствие антигена гепатита B (HBS-Ag).

Высокоочищенный АФП получают из абортивной крови методами аффинной хроматографии и гельфильтрации. Применяют АФП преимущественно парентерально.

Известно, что водные растворы АФП нестабильны в процессе хранения, поэтому задача получения высокостабильных лекарственных форм является актуальной.

Известны различные способы повышения стабильности лекарственных средств и биопрепаратов.

Наиболее эффективным способом стабилизации препаратов для целей длительного хранения является их лиофилизация с соответствующими добавками (Никитин В. В., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. М.: Колос, 1971, 344 с.).

Поскольку эффективность стабилизации путем лиофилизации зависит от особенностей активного вещества (его устойчивости к замораживанию, обезвоживанию, нагреву, регидрации, окислению и другим факторам), стабилизирующие составы являются, как правило, многокомпонентными и могут включать в себя различные углеводы, аминокислоты, белки и их гидролизаты, водорастворимые полимеры, антиоксиданты и другие вещества.

Известен, например, способ получения леофилизата ифосфамида путем замораживания активного вещества и вспомогательных веществ с последующей сушкой (Патент РФ N 1836079 кл. A 61 K 9/14, опубл. 23.08.93; БИ N 31).

Известный способ заключается в том, что водный или водно-этанольный раствор ифосфамида, содержащий 1 - 13 мас.% ифосфамида, смешивают с 0,1 - 17 мас. ч. гексита в пересчете на 1 мас. ч. ифосфамида, стерилизуют фильтрацией, фасуют в соответствующие емкости и лиофильно высушивают при температуре от -70 до 0 градусов Цельсия. В качестве гексита применяют маннит, сорбит, глюцит. Способ позволяет повысить качество целевого продукта за счет увеличения сроков хранения и повышения термостойкости.

Недостатком известного способа является его непригодность для получения стабильного препарата АФП, так как используемые в качестве стабилизатора гекситы не обладают достаточной стабилизирующей способностью в отношении АФП.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ получения препарата АФП, включающий экстракцию последнего бутиловым спиртом из абортивного материала человека, концентрирование экстракта до содержания АФП 100 мкг/мл, его стерилизацию и фасовку. (Пат. РФ N 2026688, A 61 K 47/00, 1995).

Препарат хранят при -20^oC вплоть до использования. Перед использованием (за 1 - 2 часа), АФП смешивают и инкубируют с конъюгатом доксорубицин-эстрон, взятых в эквимолярных соотношениях. В известном способе АФП используют как транспортный белок для пролонгирования действия основного компонента комплекса - доксорубицина. Недостатком известного способа является его длительность, трудоемкость и непригодность для получения стабильного препарата АФП.

Технической задачей изобретения является упрощение способа и повышение стабильности целевого продукта.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем:
Активное вещество АФП растворяют в дистиллированной воде или физиологическом растворе в количестве 0,06 - 0,09 мг/мл, затем вводят структурообразователь и стабилизатор, преимущественно реополиглюкин или полиглюкин в количестве 4 - 30 мг/мл, полученный раствор стерилизуют фильтрацией, фасуют в ампулы или флаконы и лиофильно высушивают. Лиофилизацию проводят на установке TG-50 (ФРГ) в течение 48 часов при разряжении от 200 до 325 микрон ртутного столба при температуре от -30 до +25 градусов Цельсия.

Получают препарат АФП, содержащий в 1 ампуле 0,06 - 0,09 мг АФП и 4 - 30 мг соответствующего полисахарида.

Полиглюкин (м. вес 30 - 70 кДа) используют в медицине для поддержания вязкости крови, выпускается в виде 6% раствора.

Реополиглюкин (м. вес 30 - 40 кДа) используют в медицине в качестве плазмозамещающего средства, выпускается в виде 10% раствора.

Неожиданно оказалось, что именно данные полисахариды являются оптимальными наполнителями для получения лекарственной формы АФП, так как они одновременно выполняют функцию и стабилизатора и структурообразователя. Получаемый по предлагаемому способу препарат АФП (условное название Альфетин) представляет собой пористую массу, в виде таблетки от белого до белого с сероватым оттенком цвета.

Хорошо растворим в воде или 0,9% растворе натрия хлорида. Содержимое ампулы растворяется за 0,5 - 1 минуту и не теряет активности в процессе хранения. Срок хранения 2 года при температуре не выше 20 градусов Цельсия.

Определяющим существенным отличием предлагаемого способа от прототипа является введение в раствор АФП стабилизатора и структурообразователя, в качестве которого используют полисахарид из группы декстранов, преимущественно реополиглюкин или полиглюкин в количестве 4 - 30 мг/мл, что позволяет повысить стабильность целевого продукта в процессе хранения.

При этом нижние границы количества стабилизатора (4 мг/мл) определяются минимальным содержанием сухого остатка, при котором материал (препарат) сохраняет при лиофилизации форму таблетки (Муравьев И.А. Технология лекарств. 1980 г. ). Верхний предел количества стабилизатора ограничивается вязкостью раствора АФП, полученного после растворения лиофилизата. Эскпериментально установлено, что использование полисахарида в количестве, большем 30 мг/мл, нецелесообразно из-за значительной вязкости раствора АФП, непригодных для инъекций.

В таблице представлены данные по хранению лиофильно высушенного АФП с различными стабилизаторами. При этом содержание АФП во всех экспериментах составляло 75 мкг/мл. В качестве стабилизатора и структурообразователя использовали:
1) реополиглюкин в количестве 4 мг/мл;
2) полиглюкин - 6 мг/мл;
3) декстран (м. вес 100 кДа) - 5 мг/мл;
4) сахароза ("ХЧ") - 50 мг/мл;
5) глюкоза (Фарм) - 50 мг/мл;
6) фосфатно-солевой раствор - 0,01 М Na-фосфатный буфер pH 7,2 0,2 М NaCl (ФСР).

В качестве эталона сравнения был получен препарат АФП без стабилизатора с содержанием активного вещества - 75 мг/мл.

Из таблицы видно, что препараты АФП, полученные предлагаемым способом (прим. 1 - 3) обладают хорошей повторной растворимостью и стабильностью в процессе хранения. Препараты (прим. 4 - 6), где в качестве стабилизатора использованы дисахариды или ФСР, обладают худшей растворимостью и стабильностью в процессе хранения. И, наконец, препарат АФП, полученный лиофилизацией без добавок в качестве стабилизатора реополиглюкина или полиглюкина обладает неудовлетворительной растворимостью и пониженной стойкостью при хранении.

Известно использование различных углеводов в качестве крио- и ксеропротекторов при лиофилизации различных препаратов (1 - 3). Однако, использование таких полисахаридов, как реополиглюкин и полиглюкин в качестве структурообразователей и стабилизаторов одновременно при лиофилизации высокоочищенного специфичного белка - АФП - является новым, неизвестным ранее качеством. Преимущественное использование вышеназванных полисахаридов определяется их доступностью (выпускаются отечественной промышленностью), разрешенностью использования в медицине и приемлемой ценой. Можно использовать импортные декстраны, например декстран с м. вес. 32,60 и 100 кДа производство фирмы Serva, однако их использование ограничено экономическими факторами.

В связи с тем, что в известных источниках аналогичного способа получения препарата АФП с использованием в качестве стабилизатора и структурообразователя полисахарида из группы декстранов не обнаружено, то можно сделать вывод о соответствии заявляемого способа критерию изобретения "новизна".

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Для приготовления препарата АФП в 1 л воды растворяют при перемешивании 750 мг АФП и 50 г реополиглюкина, затем доводят водой до 10 л. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с размером пор не более 0,22 микрона, фасуют в 10000 ампул или флаконов по 1 мл (разовая доза) и лиофильно высушивают в асептических условиях. Одна ампула (флакон) содержит 75 мкг АФП и 5 мг реополиглюкина. Каждую партию препарата проверяют на соответствие требованиям к качеству целевого продукта.

Препарат полностью растворяется в 1 мл воды или 0,9% NaCl в течение 0,5 мин.

Содержание белка в 1 дозе (ампуле) составляет 75 мкг (по методу Лоури).

Специфическую активность препарата определяют количеством содержащегося в нем АФП, определение которого проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов реагентов или тест-систем для определения концентрации АФП.

Содержание АФП в 1 дозе (ампуле) составляет 75 мкг. Подлинность препарата определяют по результатам иммунохимической и электрофоретической идентификации АФП и электрофоретической оценки чистоты препарата.

Препарат тестируют на отсутствие примеси белков сыворотки крови человека методом дот-блоттинга с использованием антител против белков сыворотки крови человека.

Пример 2.

Способ осуществляют аналогично примеру 1, но в 1 л воды растворяют 750 мг АФП и 50 г полиглюкина. Получают препарат, содержащий (в ампуле) 75 мкг АФП и 5 мг полиглюкина.

Препарат растворяется в течение 0,5 минуты, сохраняет стабильность в течение 2-х лет.

Пример 3.

Способ осуществляют аналогично примеру 1, но в 1 л 0,9%-ного NaCl растворяют 600 мг АФП и 100 мг реополиглюкина. После лиофилизации получают препарат, содержащий в 1 ампуле 60 мкг АФП и 10 мг реополиглюкина. Препарат растворяют в течение 1 минуты. Сохраняет стабильность в течение 2-х лет.

Пример 4.

Способ осуществляют аналогично примера 1, но в 1 л воды растворяют 700 мг АФП и 70 г полиглюкина, доводят водой до 10 литров. Получают препарат, содержащий в 1 ампуле 70 мкг АФП и 7 мг полиглюкина. Препарат растворяется в течение 0,5 минуты, сохраняет стабильность в течение 2-х лет.

Пример 5.

Способ осуществляют аналогично примеру 1, но в 1 л 0,9%-ного NaCl растворяют 900 мг АФП и 300 г реополиглюкина. Получают препарат, содержащий в 1 ампуле 90 мкг АФП и 30 мг реополиглюкина. Препарат растворяется в течение 1 минуты. Сохраняет стабильность в течение 2-х лет.

Пример 6.

Способ осуществляют аналогично примеру 1, но в 1 л воды растворяют 800 мг АФП и 80 г полиглюкина, затем доводят объем раствора до 10 литров. Получают препарат, содержащий в 1 ампуле 80 мкг АФП и 8 мг полиглюкина. Препарат растворяется в течение 0,5 минуты сохраняет стабильность в течение 2-х лет.

Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом
повысить стабильность препарата АФП в процессе хранения,
улучшить повторную растворимость препарата в воде или физрастворе для инъекций,
обеспечить возможность получения устойчивой таблеткообразной пористой массы, исключить потерю препарата при вскрытии ампул.

Источники информации
1. Никитин В. В. Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. М.: Колос, 1971, 344 c.

2. Долинов К. Е. Основы технологии сухих биопрепаратов -М.: Медицина, 1969, 231 c.

3. Патент РФ N 2022559, МКИ 5 A 61 K 35/54 "Способ получения препарата онковариального альфа - 1-глобулина", опубл. 15.11.94, Бюл. N 21.

4. Патент РФ N 1836079, МКИ 5 A 61 K 9/14 "Способ получения лиофилизата", опубл. 23.08.93, Бюл. N 31.

5. ПР N 7 на производство препарата альфа-фетопротеина для инъекций, утв. 1995 г.

6. Муравьев И.А. Технология лекарств, 1980 г.

Способ предназначен для получения препарата альфа-фетопротеина и может быть использован в фармацевтической промышленности и медицине. Альфа-фетопротеин растворяют, вводят полиглюкин или реополиглюкин в количествах 4-30 мг/мл, фасуют в ампулы или флаконы и лиофильно высушивают. В результате одна ампула содержит 0,06 - 0,09 мг альфа-фетопротеина и 4-30 мг полиглюкина или реополиглюкина. Способ позволяет упростить процесс и получить более стабильный продукт. 1 табл.

1. Способ получения препарата альфа-фетопротеина, отличающийся тем, что альфа-фетопротеин растворяют, вводят полисахарид в количестве 4 - 30 мг/мл, осуществляют фасовку в ампулы или флаконы и лиофильное высушивание. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полисахарида используют реополиглюкин или полиглюкин. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при фасовке в ампулы помещают раствор в количестве, обеспечивающем содержание в лиофилизированном препарате 0,06 - 0,09 мг альфа-фетопротеина и 4 - 30 мг реополиглюкина или полиглюкина на одну ампулу.