СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНА ТЕРМОСТАБИЛЬНОГО ЭНТЕРОТОКСИНА У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/68 C12N15/31 C12N15/00 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской микробиологии, и может использоваться для анализа клинических образцов в процессе расшифровки этиологии и особенностей патогенеза связываемых с УПЭ инфекционных процессов.

Известен способ обнаружения ST-энтеротоксигенных Escherihia coli методом блот-гибридизации с помощью 23-членного олигонуклеотида, комплиментарного гену STa-токсина E.coli (Echeverria P., Taylor D.N., Seriwatana J., Brown E. , Lexomboon U. Examination of colonies and stool blots for detection of enteropathogens by DNA hybridization with eight DNA probes. // J. of Clin. Microbiol. - 1989. - v. 27, N 2. - p. 331 - 334.) Использовали синтетический 23-членный олигонуклеотидный зонд для определения гена STa-гена E. coli. Фильтры с тестируемыми полинуклеотидными пробами инкубировали в гибридизационном растворе следующего состава: 50% формамида, 5хССЦ (1хССЦ из 0,15 М NaCl и 0,15 цитрата натрия), 0,1% СДС, 1 мМ ЭДТА и раствора Денхардта (0,02% Фиколл, 0,02% поливинилпиррролидона, 0,2% бычьего сывороточного альбумина). Затем помещали в свежий гибридизационный раствор, содержащий денатурированный нагреванием ДНК и аналогично обработанную ДНК тимуса теленка в концентрации 75 мкг/мл, после чего инкубировали ночь при 37^oC. Гибридизацию с меченым γ-³²P-олигонуклеотидным зондом осуществляли в течение ночи при 50^oC, высушивали на воздухе и радиоавтографировали в течение 24 часов при -70^oC.

При этом используется менее специфичный 23-членный олигонуклеотид, обнаруживается только один тип известных ST-генов Escherihia coli, и не определяются гены ST-токсинов у штаммов УПЭ других видов. Принципиальная возможность применения предложенного авторами подхода относительно других представителей Enterobacteriaceae в каждом конкретном случае требует экспериментального подбора соответствующего олигонуклеотида, что ведет к увеличению стоимости исследования и не всегда практически осуществимо.

Целью изобретения является расширение спектра выявляемых методом дот-блот гибридизации ST-генов и возможность их обнаружения у представителей целого семейства Enterobacteriaceae, что существенно снизит временные и материальные затраты, значительно повысит информативность и диагностическую ценность исследований.

На фиг. 1 изображены результаты сравнительного анализа аминокислотных последовательностей известных в настоящее время термостабильных энтеротоксинов.

Проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих термостабильные энтеротоксины E. coli, методом Clustal с использованием программы Megaline из пакета программ Lasergene ("DNA Star"), проанализированы последовательности генов estA1, estA2, estA3, estA4, est1a и степень гомологии последовательности 30-членного олигонуклеотидного зонда к консервативному участку генов.

На фиг. 2 - 5 изображены радиоавтографические результаты дот-блот гибридизации при использовании предложенного олигонуклеотида с энтеробактериями различных видов.

Способ определения осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК.

Клетки культивируют при 37^oC в жидкой LB-среде в течение ночи, 1 мл суспензии клеток осаждают при 12000 об/мин на центрифуге типа "Eppendorf". Осадок ресуспендируют и разводят в буфере, содержащем 50 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl (pH 8,4), 2,5 мМ MgCl₂, 0,01% желатин, до конечной концентрации 10⁸ КОЕ/мл. Лизирование осуществляют лизоцимом ("Serva") в концентрации 1 мг/мл в течение 15 мин при комнатной температуре (22 - 25^oC) с последующим добавлением протеиназы K ("Serva") до конечной концентрации 200 мкг/мл и инкубированием в течение 30 мин при 60^oC. Фермент инактивируют кипячением - 15 мин. Хранение образцов перед использованием осуществляют при 4^oC.

Дот-блот гибридизация.

ДНК наносят на нитроцеллюлозный фильтр, при этом ее количество соответствует содержанию в 10⁵-10⁶ КОЕ/мл. Фиксацию ДНК на фильтре производят при 80^oC под вакуумом. В качестве генетического зонда используется 30-членный олигонуклеотид, радиоактивно меченый по 5'-концу (γ -³²P). Гибридизацию ДНК с приведенным выше олигонуклеотидным зондом и последующую отмывку фильтра производят при температуре 55^oC по методике (Maniatis T., Fritsch F.F., Sambrook J. (1982) Molecular cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.). Высушенный фильтр радиоавтографируют в течение ночи.

Для определения гена термостабильного энтеротоксина методом дот-блот гибридизации в качестве генетического зонда используется 30-членный олигонуклеотид (5'-TGCTGTGAANTNTGTTGTAATCCTGCCTGT-3'), сконструированный нами на основании анализа аминокислотных и нуклеотидных последовательностей, соответствующих высококонсервативному участку всех известных в настоящее время ST-энтеротоксинов Enterobacteriaceae и Vibrionaceae (фиг. 1, 2).

В качестве примера исследовали музейные и клинические штаммы Escherihia spp., Citrobacter spp. и Yersinia spp., ST-энтеротоксигенность которых верифицирована in vivo на модели мышей-сосунков. Результаты приведены в таблице.

Пример 1.

Выделили ДНК 20 клинических штаммов Citrobacter spp., которую исследовали методом дот-блот гибридизации при использовании 30-членного олигонуклеотидного зонда со следующей нуклеотидной последовательностью: (5'-TGCTGTGAARRRTGTTGTAATCCTGCCTGT-3'). Результаты радиоавтографии приведены на фиг. 2.

Пример 2.

Выделили ДНК 5 клинических штаммов E. coli, которую исследовали методом дот-блот гибридизации при использовании 30-членного олигонуклеотидного зонда со следующей нуклеотидной последовательностью: (5'-TGCTGTGAAATATGTTGTAATCCTGCCTGT-3'). Результаты радиоавтографии приведены на фиг. 3.

Пример 3.

Выделили ДНК 10 музейных штаммов E. coli, которую исследовали методом дот-блот гибридизации зонда со следующей нуклеотидной последовательностью: (5'-TGCTGTGAACTCTGTTGTAATCCTGCCTGT-3'). Результаты радиоавтографии приведены на фиг. 4.

Пример 4.

Выделили ДНК 3 музейных штаммов Y. enterocolitica, которую исследовали методом дот-блот гибридизации при использовании 30-членного олигонуклеотидного зонда со следующей нуклеотидной последовательностью (5'-TGCTGTGAAGTGTGTTGTAATCCTGCCTGT-3'). Результаты радиографии приведены на фиг. 5.

Проведенные исследования свидетельствуют, что предложенный способ определения гена термостабильного энтеротоксина у представителей семейства Enterobacteriacea с помощью сконструированного нами олигонуклеотидного зонда является эффективным, носит универсальный характер и позволяет выявлять ST-гены УПЭ вне зависимости от их видовой принадлежности.

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии. Способ осуществляется методом дот-блот гибридизации с использованием олигонуклеотидного зонда. В качестве олигонуклеотидного зонда используют 30-членный олигонуклеотид, гомологичный высококонсервативному участку известных ST - энтеротоксинов Enterobacteriaceae с установленной нуклеотидной последовательностью: 5'-TGCTGTGAANTNTGTTGTAATCCTGCCTGT-3'. Использование олигонуклеотидного зонда позволяет выявлять ST-гены вне зависимости от их видовой принадлежности. 5 ил., 1 табл.

Способ определения гена термостабильного энтеротоксина у представителей семейства Enterobacteriaceae, включающий дот-блот гибридизацию с использованием олигонуклеотидного зонда, отличающийся тем, что в качестве олигонуклеотидного зонда используют 30-членный олигонуклеотид, гомологичный высококонсервативному участку известных ST - энтеротоксинов Enterobacteriaceae, со следующей нуклеотидной последовательностью: 5'-TGCTGTGAANTNTGTTGTAATCCTGCCTGT-3'.