СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ МЕЛИОИДОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12N7/00 A61B10/00 

Изобретение относится к лабораторной диагностике мелиоидозной инфекции и основано на обнаружении в образцах клинических изолятов особого мелиоидозного бктериофага ДI.

У больных животных и человека возбудитель мелиоидозной инфекции может быть выявлен из содержимого абсцессов, мокроты, гнойного отделяемого язы, рвотных масс. При острой септической форме возбудитель инфекции обнаруживается в крови, моче, цереброспинальной жидкости, полостных эксудатах. Способы обнаружения бактерий Pseudomonas pseudomallei описаны в методических рекомендациях "Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза" (Илюхин В. И. , Замараев В.С., Батманов В.П., и др., Волгоград, 1994 г.) и включают в себя посевы материала клинических изолятов в мясо-пептонный бульон с 4% глицерина, на мясо-пептонный агар с 4% глицерина и селективные среды; отбор подозрительных колоний; постановку биопробы; идентификацию выделенной культуры микроорганизма с помощью биохимических и генетических тестов.

В целом на лабораторную диагностику мелиоидозной инфекции затрачивается от 3 до 6 сут.

Попытка выявления стабильных признаков видовой принадлежности у мелиоидозных бактерий для реакции агглютинации не увенчалась успехом.

Еще менее разработано фаготипирование штаммов P. pseudomallei. До настоящего времени использование фагочувствительности или фагопродукции возбудителя мелиоидоза, как инструмента лабораторного анализа, не производилось.

Целью настоящего изобретения является создание способа ранней лабораторной диагностики мелиоидозной инфекции.

Поставленная цель достигается тем, что в образцах клинических изолятов с помощью ализогенного штамма P. pseudomallei СВБДО (А.с. N 1171524) в качестве индикаторной культуры обнаруживается мелиоидозный бактериофаг ДI.

Бактериофаг ДI, впервые выявленный нами и не находивший применения в диагностике мелиоидоза, относится к "бесхвостым" бактериофагам и обладает патогенными свойствами по отношению к экспериментальным животным, цитопатогенным действием к культуре клеток, способен лизировать эритроциты животных и человека. Практически, все вирулентные штаммы возбудителя мелиоидоза лизогенны по этому фагу. Он спонтанно продуцируется бактериями P. pseudomallei уже в первые часы инфицирования возбудителем мелиоидоза, распространяется в макроорганизме и может быть найден в крови, лимфе, слюне, моче, цереброспинальной жидкости. Для его выявления необходимо образцы клинических изолятов обработать хлороформом для обеспложивания бактерий и посеять на индикаторную культуру. Спустя 18 ч инкубации при обнаружении негативных колоний на чашке с индикаторной культурой можно с 100% достоверностью диагностировть инфицирование макроорганизма вирулентным штаммом возбудителя мелиоидоза.

Способ ранней диагностики мелиоидоза проводится следующим образом.

Кровь, мочу, цереброспинальную жидкость, эксудат или другой материал обрабатывают хлороформом в соотношении 10:1 и после выдерживания 1 ч при 37^oC центрифугируют при 6 - 7000 об/мин в течение 10 - 15 мин для разделения фаз. Водную фазу наносят дорожкой на индикаторную культуру P. pseudomallei СВБДО-141, заключенную в 0,5% МПА. Для этого используют суточную бульонную культуру P. pseudomallei СВБДО-141, выращенную на МПБ при 37^oC. 0,2 - 0,3 мл этой культуры вливают в 2 мл расплавленного 0,5% МПА и наслаивают на чашку с 1,5% МПА. Чашку инкубируют 18 ч. при 37^oC. После чего учитывают результаты анализа. В качестве контроля используют фаг ДI, который высеивают второй дорожкой. Положительным результатом считается наличие по ходу капли изолята негативных колоний и сплошного лизиса по ходу капли с бактериофагом ДI (положительный контроль).

Таким образом, постановку диагноза мелиоидозной инфекции с помощью этого способа можно осуществить в течение 1 сут с момента получения клинических изолятов, т.е. в период начальной фазы инфекционного процесса.

Пример 1. Проводилось обнаружение бактериофага ДI в клинических изолятах, полученных от экспериментально зараженных мелиоидозом золотистых хомячков. Подопытным животным подкожно вводили 25 LD₅₀ суточной бактериальной культуры типичного мелиоидозного штамма Pseudomonas pseudomallei C-141. Животных забивали через 2 сут после заражения. Отбирали кровь, а из внутренних органов готовили суспензии: 2 г органа растирали в ступке со стерильным речным песком, заливали 5 мл фагового буфера (Na₂HPO₄ - 7 г, KH₂PO₄ - 3 г, NaCl - 5 г, 0,1M Mg₂SO₄ - 10 мл, 0,01M CaCl₂ - 10 мл, H₂O - до 1000 мл, pH 7,2). После 15 мин экстракции отбирали надосадочную жидкость. Далее кровь и надосадочную жидкость смешивали и эмульгировали с хлороформом в соотношении 10: 1. После разделения фаз (методом отстоя при комнатной температуре или, что предпочтительнее, путем центрифугирования при 6 - 7000 об/мин, 5 - 10 мин) водную фазу наносили в количестве 1 - 2 капель дорожкой на двуслойный агар с индикаторной культурой. В качестве индикаторной культуры использовали ализогенный штамм P. pseudomallei СВБДО (а.с. N 1171524), суточную бульонную культуру которого заключали в верхний агаровый слой. Рядом с опытной дорожкой наносили каплю фага ДI - в качестве контроля индикаторной культуры. Спустя 18 ч инкубации при 37^oC на чашке по ходу движения капли надосадочной жидкости клинических изолятов обнаруживались негативные колонии. При наличии положительного контроля - появление негативных колоний на дорожке фага DI можно со стопроцентной гарантией считать об инвазии организма животного вирулентным штаммом возбудителя мелиоидоза.

Таким образом, благодаря предлагаемому способу стало возможным проводить диагностику мелиоидоза в течение первых суток после получения клинических изолятов, в самом начале инфекционного процесса и задолго до появления иммунного ответа.

Пример 2. Проводилось определение наличия спонтанной фагопродукции и лизогенного состояния по фагу ДI у музейных мелиоидозных культур.

К 5 мл мелиоидозной культуры, выращенной на мясо-пептонном бульоне с 5% глицерина, pH 7,2 при 37^oC в течение 2 сут добавляли 0,5 мл хлороформа и перемешивали до получения молочно-белой эмульсии. Пробирки выдерживали 1 ч при 37^oC, а затем ночь при 4^oC. 1 - 2 капли водной фазы хлороформного лизата наносили на индикаторный тест-штамм - P. pseudomallei СВБДО-141, заключенный в агар методом агаровых слоев по Грациа. Чашки инкубировали при 37^oC в течение 18 ч и проводили учет опыта. О наличии спонтанной фагопродукции судили по образованию отдельных негативных колоний или сплошного лизиса индикаторной культуры по ходу движения капли хлороформных лизатов. Результаты опытов по выявлению спонтанной фагопродукции бактериофага ДI представлены в таблице.

Состояние лизогении по мелиоидозному фагу ДI у музейных мелиоидозных культур определяли следующим образом. 1 - 2 капли мелиоидозного бактериофага ДI наносили дорожкой на газон испытываемых культур, также заключенных в агар, используя метод агаровых слоев по Грациа. Отсутствие лизиса испытываемой мелиоидозной культуры при положительном контроле - лизисе препаратом фага ДI тест-штамма P. pseudomallei СВБДО-141, свидетельствовало в лизогении этих культур фагом ДI, так как мелиоидозные штаммы всегда устойчивы к собственным фагам. Результаты выявления состояния лизогении по фагу ДI представлены в таблице.

Таким образом, среди музейных мелиоидозных штаммов наблюдаются лизогенные по фагу ДI штаммы, среди которых большинство спонтанно продуцируют фаг ДI, а также есть штаммы, не лизогенные по фагу ДI. Такие штаммы, как правило, слабовирулентны или, практически, авирулентны.

Пример 3. Проводилось электронно-микроскопическое исследование мелиоидозного бактериофага ДI.

Для выделения чистой линии бактериофага DI хлороформный лизат 2 суточной бульонной культуры P. pseudomallei C-141 "R", выращенной при 37^oC, высевали на газон индикаторной культуры P. pseudomallei СВБДО-141 до получения изолированных негативных колоний. Культуру бактериофага из одной негативной колонии 2 мм в диаметре брали платиновой петлей и помещали в мясо-пептонный бульон с культурой P. pseudomallei СВБДО-141. Посев инкубировали при 37^oC 18 - 20 ч, а затем хлороформировали. Хлороформный лизат титровали методом агаровых слоев по Грациа. Отбирали негативную колонию, аналогичную исходной, и повторяли операцию еще 10 раз. Отклонированный бактериофаг ДI формировал однородные негативные колонии на индикаторном штамме P. pseudomallei СВБДО-141.

Бактериофаг ДI культивировали на газоне индикаторной культуры до получения сливного лизиса на чашках Петри с мясо-пептонным агаром, pH 7,2. Чашки с фаговым лизатом обрабатывали парами хлороформа, экстрагировали 5 мл фагофого буфера, pH 7,5 при 4^oC в течение ночи. Собранный с чашек фаговый лизат хлороформировали и освобождали от обломков бактериальных клеток центрифугированием в течение 10 мин при 7000 об/мин. Титр фага в лизате составлял 10⁷-10⁸ БОЕ/мл. Полученный препарат бактериофага ДI обладал способностью формировать четкую дорожку лизиса на индикаторной культуре.

Препарат фага ДI наносили на электронно-микроскопическую сетку, покрытую формваровой пленкой, которую укрепили углеродом. Спустя 40 - 60 сек избыток влаги удаляли с сетки и окрашивали 40 - 60 сек 1% раствором уранилацетата. Полученные препараты просматривали в электронном микроскопе УЕМ-100 X при увеличении 80 - 100 тысяч крат.

При электронной микроскопии частица бактериофага (см. фото) представляет собой головку без хвостового отростка. На плоскости фаг ДI имеет гексагональную форму с размерами 40 - 60 нм.

Таким образом, бaктериофаг ДI относится к бесхвостовым фагам, имеет гексагональную форму с размерами от 40 до 60 нм.

Пример 4. Проводилось определение цитопатического и патогенного действий бактериофага ДI.

Для определения цитопатического действия фага ДI использовали монослой клеток Hep 2 в возрасте 3 суток. В пробирки с клетками Hep 2 добавляли бактериофаг ДI и выдерживали в течение 5 суток при 37^oC с ежедневным просмотром под микроскопом. В качестве контроля параллельно ставили опыт с физиологическим раствором (контроль клеток) и гретым при 100^oC в течение 15 мин препаратом фага (контроль фаговой активности). О цитопатическом действии бактериофага ДI судили по характеру роста клеток Hep 2. Они под его воздействием принимали округлую форму, отслаивались от стенок пробирки, при сохранении четкого монослоя в контроле с физиологическим раствором и обеспложенным прогреванием фагом.

Препарат фага ДI уже на 2 сутки дезагрегировал монослой клеток Hep 2.

При определении патогенного действия бактериофага ДI золотистым хомячкам внутрибрюшинно был введен препарат фага ДI в объеме 0,5 мл в концентрации 10⁹ БОЕ/мл. На 4 сутки часть экспериментальных животных пала. При вскрытии павших животных обратило на себя внимание отличие, по сравнению с контрольными животными, внешнего состояния внутренних органов и тканей. У павших животных наблюдалось усиление рисунка кровеносных сосудов, подходящих к паховым лимфатическим узлам. Ткани несколько увеличенных паренхиматозных органов (печень, легкие, селезенка) рыхлые, гиперемированные.

Вскрытие выживших экспериментальных животных показало резкое истощение, полное отсутствие подкожного и внутрибрюшинного жира. В легких мелкие серые узелки. В остальном без особенностей.

Высев экстракта внутренних органов павших золотистых хомячков на индикаторную культуру показал наличие фага ДI.

Таким образом, благодаря предлагаемому способу, стало возможным проводить диагностику мелиоидоза в течение первых суток после получения клинических изолятов, в самом начале инфекционного процесса, задолго до появления иммунного ответа.

Способ может быть использован при лабораторной диагностике мелиоидозной инфекции. Клинические изоляты биологических жидкостей обрабатывают хлороформом в соотношении 10:1. Проводят разделение фаз жидкостей центрифугированием при 6-7000 об/мин в течение 10-15 мин. Наносят каплю водной фазы дорожкой на индикаторную культуру Pseudomonas pseudomallei СВБДО-141, помещенную в полужидкий агар. Инкубируют при 37^oC в течение 18 ч, и по наличию негативных колоний по ходу движения капли определяют инвазию микроорганизма возбудителем мелиоидоза. Способ сокращает диагностику мелиоидоза до 1 суток с момента поступления клинических изолятов биологических жидкостей, т.е. в период начальной фазы инфекции и задолго до появления иммунного ответа. 1 ил., 1 табл.

Способ ранней диагностики мелиоидозной инфекции, включающий получение образцов клинических изолятов и диагностику инвазии макроорганизма, отличающийся тем, что образцы клинических изолятов обрабатывают хлороформом в соотношении 10 : 1, центрифугируют при 6 - 7000 мин^-1 в течение 10 - 15 мин, после чего водную фазу наносят дорожкой на индикаторную культуру Pseudomonas pseudomallei СВБДО-141 в двуслойном агаре и инкубируют при 37^oС в течение 18 - 20 ч, при этом диагностику инвазии макроорганизма возбудителем мелиоидоза и начальной фазы мелиоидозной инфекции осуществляют по наличию негативных колоний по ходу капли.