Штамм @ @ ( @ ) N71 и способ получения ларвицидного препарата на его основе Советский патент 1987 года по МПК A01N63/00 

1 11 Изобретение относится к микробиологическим средствам борьбы с кровососущими комарами и представляет собой новый штамм Bacillus thuringiensis 14-го серотипа (Н«), предназначенный для изготовления бактериального препарата бактокулицида, и способу получения такого препарата. Известен штамм Bacillus thuringiensis ( 266/2 из коллекции ССЕВ (ЧССР). Этот штамм не обладает стабильноетью и при хранении диссоциирует с образованием гладких и шероховатых вариантов с пониженной продуктивностью, причем гладкие варианты полностью лишены вирулентности, а также спонтанно продуцируют вирулентный фаг в куль1УР «Известен также ряд способов производства энтомопатогенных препаратов на основе Bacillus thuringiensis. Так, например, известен способ производства препарата энтобактерина путем глубинного выращивания продуцента в течение 30-35 ч на жидкой питательной среде с аэрацией при 29-3It с высушиванием микробной массы вместе с культуральной жидкостью при 115 и последующей стандартизации препарата путем добавления наполнителя. Однако указанный способ не позволяет получать препарат с титром вьш1е 30-40 млрд. спор в 1 кг. Цель изобретения - повьш1ение выхода и вирулентности препарата на основе Bacillus thuringiensis. Дпя достижения цели предлагаются штамм Bacillus thuringiensis (Н) (коллекция ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии) продуцент ларвицидного токсина, и способ получения ларвицидного препарата на основе Bacillus thuringiensis, включающий глубинное культивирование бактерий и высушивание культуральной жидкости, ртличающийся тем, что с целью повышения выхода и ларвицидной активности препарата, в качестве шт-амма используют Bacillus thuringiensis (Н № 71, который выращивают на дрожжеполисахаридной среде, культуральную жидкость .концентрируют путем сепарирования, к концентрату добавляют хлористый натрий в количестве 35-40% к содержанию сухих веществ в концентрате и полученную смесь высушивают путем распылительной сушки. 50242 Штамм (IIJ №71 представляет собой грамположительные палочки активно . подвижные, длина 2,9-3,8, ширина 0,91,1 мкм, споруляция начинается через 536-48 ч. При этом образуются субтерминальные споры эллиптической формы диаметром 0,9-1,1 мкм и параспоральные включения неправильной формы и неодинаковые по размеру:. 0,5 х 0,4 101,4 х 1,2 мкм. Культурально-физиологические признаки. На мясо-пептонном агаре (МПА) через 5 сут инкубации при образу15ет средней величины колонии диаметро„ 1,2-1,8 см, с волнистым слегка опущенным краем, матовой мелкошероховатой поверхностью по краям и блестящей к центру колонии. 20 Цвет серовато-бежевый или с розоватым оттенком. Посев штрихом. Через 5 сут инкубации при 2бС на МПА культура растет обильно, край мелкозубча25 ый, неровный, поверхность матовая, в центре штриха - мелкошероховатая, консистенция вязкая. Окраска питательной среды не меняется, Посев уколом. Рост по уколу на 30 мпА корневидный по всей длине и поверхности. На мясо-пептонном бульоне (МПБ) через сутки инкубации при образует поверхностную пленку и помутнение среды, на 5-е сутки - осадок бе лого цвета. Отношение к углеводам. Сбраживает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, глицерин, крахмал, маннозу, 40 трегалозу. Не сбраживает сахарозу, лактозу, арабинозу, ксилозу, галактозу, рамнозу, рафинозу, левулезу, сорбит, дульцит, маннит, салицин, Гидролизует крахмал, разжижает 45 желатину, молоко пептонизирует. Антигенные свойства - относится к Н - серотипу. , . Антагонистические свойства - не 50 ° отношению к культурам Bacillus thuringiensis другид серотипов (Н - Н). Патогенные свойства, Обладает высокой токсичностью для 55 личинок комаров. Хранить штамм рекомендуется в виде лиофильно-высушенной культуры в стерильных запаянньпс ампулах при 4 или в кристаллах хлористого натрия в стерильных пробирках в обычных условиях. . Производственные показатели штамма - прототипа и предлагаемого штамма сранивались при выращивании их глубинным методом-на дрожжеполисахаридной среде. Данные приведены в табл. 1 и 2. Продуктивность штаммов (мпрд. спор/МП культ.жидкости). Как показывает таблица, предлагаемый штамм 71 в 3 с лишним раза продуктивнее штамма-прототипа 266/2. Титр спор и кристаллов.в готовом продукте, полученном на основе предложенного и применявшегося ранее штаммов, приведен в табл. 2. Как показывает таблица, использование предлагаемого штамма позволяет получить препарат, в котором титр спор выше, чем в случае использования штамма - прототипа почти вЗ раза Определение ларвицидной активности готовых препаратов, полученных 1) с использованием штамма-прототипа и 2) с использованием предложенных штамма и способа получения препарата на его основе, показало, что в пер-, вом случае доза личинок 4-го возраста комара Aedes aegypti составила 0,29 мг/л, а во втором- 0,12 мг/л, .и следовательно, изобретение дает возможность повысить ларвицидную активность препарата в 2,5 раза. Пример осуществления изобретения. Штамм (Щ 71 выращивают в. пробир ках поверхностным методом на МПА в течение 7 сут при . . Полученную культуру используют дл засева колб с жидкой питательной ере дои следующего состава, %: дрожжи сухие кормовые 2,0; мука кукурузная 1,5i вода водопроводная остальное рН среды 7,0-7,2. Культуру в колбах выращивают на качалке (200-280 об/ми в течение 72 ч при 28-30С до полног спорообразования и нспользуют ее в качестве посевного материала. Для получения ларвицидного препарата культуру выращивают глубинным методом на ферментационной среде сос тава, %: Дрожжи сухие кормовые Мука кукурузная Вода водопроводная Остальное рН среды 7,0-7,2 Культивирование осуществляют при 28-30 с при постоянном перемешивании и аэрации среды. Длительность ферментации 35-40. ч. После окончания ферментации культуральную жидкость, содержащую опоры и кристаллы зндотоксина Bacillus thuringiehsls (, а .также остатки пи- тательной среды подвергают концентрированию методом сепарирования. К полученному концентрату культуральной жидкости перед высушиванием добавляют хлористый натрий в количестве 35-40% (в расчете на содержание сухих веществ в концентрированной культуральной жидкости) и высушивают в распылительной сушильной установке при следующих условиях: температура сушильного агента на входе в сушильную башню 130-140, на выходе 70-75С. Полученный сухой продукт, содержащий споры и кристаллы эндотоксина Bacillus thuringiensis (Н, используют в качестве, ларвицидного средства для борьбы с кровососущими комарами, .Полученный препарат имеет следующий состав, мас.%: Спорокристаллический комплекс15-16 Остатки питательной среды45-49 Наполнитель (хлористый натрий) 35-40 Использование предлагаемого высокопродуктивного штамма Bacillus thuringiensis 71 и способа получения на его основе препарата, в особенности введения хорошо растворимого в воде наполнителя (хлористый натрий), позволяет получить после высушивания мелкодисперсный хорошо растворимый высококонцентрированный порошок бактокулицида, превосходящий по своим показателям, как было показано ранее, известные препараты в 2,5-3 раза.

Таблица Г

1. Штамм Bacillus thuringiensis (Н № 71 (коллекция ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии) продуцент ларвицидного токсина 2. Способ получения ларвицидного препарата на основе штамма Bacillus churingiensis, включающий ег,о глубинное культивирование и-высушивание культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и ларвицидной активности препарата, в качестве штамма используют Bacillus thuringiensis (Н №71, сл который выращивают на дрожжеполисахаридной среде, культуральную жидкость концентрируют путем сепарирования, к концентрату добавляют хлористый натрий в количестве 35-40% к содержанию С сухих веществ в концентрате и полученную смесь высушивают пу;гем распыпительной сушки. 00 ел .0 к 4

266/2 (ССЕВ)

0,87;0,81; 0,820,045

0,78 Титр спор и кристаллов в готовом продукте Таблиц ai2 (млрд/л)