ИНГИБИТОР РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ Российский патент 2000 года по МПК C12N9/99 C12N9/88 C07D498/12 

Изобретение относится к биохимии, в частности к применению производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I:

где если m = 0, то n = x = 0, y = 2-12 и z = 1, или n = x = y = 1 и z = 2, или n = x = z = 1 и y = 3, или n = y = 1, x = 0 и z = 2 или 3, или если m = 1, то n = x = 0, y = 3 и z=l, в качестве ингибиторов растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ).

Согласно данному изобретению предпочтительно применение соединений общей формулы I, где m = n = x = 0, у = 2-12 и z = 1.

Предпочтительно применение производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I, где m = n = x = 0, y = 4 или 8 и z = 1, в качестве ингибитора базальной активности и гем-независимой стимуляции рГЦ.

Предпочтительно применение производного азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I, где m = n = x = 0, y = 8 и z = 1, в качестве ингибитора NO-зависимой активации рГЦ.

Изобретение может быть использовано в биохимии для изучения регуляторных эффектов оксида азота и механизма действия рГЦ.

Гуанилатциклаза /КФ 4.6.1.2. ; гуанозин-5'-трифосфат-пирофосфатлиаза (циклизующая)/ является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3', 5'-циклофосфата (цГМФ) - универсального регулятора внутриклеточного метаболизма [1]. ГЦ существует в двух формах - мембранной и растворимой и играет ключевую роль в регуляции таких физиологических процессов, как сокращение и расслабление гладких мышц кровеносных сосудов и агрегация тромбоцитов. Основным эндогенным активатором рГЦ является оксид азота, который в результате взаимодействия с атомом железа гема, входящего в состав фермента, образует комплекс нитрозил-гем. Известны также соединения, способные активировать рГЦ по гем-независимому механизму: например, протопорфирин IX, ионы Mn²⁺, арахидоновая кислота и др.

В настоящее время для изучения возможного участия рГЦ в различных физиологических процессах, применяют ингибиторы данного фермента, в частности 3,7-бис(диметиламино)феназатионийхлорид (метиленовый синий), 6-(фениламино)-5,8-хинолиндион (LY 83583) и 1H-[1,2,4]-оксадиазоло[4,3-a]хиноксалин-1-он (ОДХ) [1]. Данные соединения являются ингибиторами NO-зависимой активации рГЦ.

Известно применение для ингибирования базальной активности рГЦ различных модификаторов тиольных групп, а именно: N-этилмалеимида и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) [2].

Недостатком вышеуказанных соединений является низкая эффективность ингибирующего действия.

Известно ингибирование базальной активности рГЦ динитрилом 3,4-дигидроксибензилиденмалоновой кислоты формулы II:

Однако данное соединение также недостаточно эффективно ингибирует рГЦ [3] . Его действие на гем-зависимую и гем-независимую активацию рГЦ не изучено.

Известны различные азопроизводные гетероциклических соединений [4]. Их действие на рГЦ до настоящего времени не изучено.

Наиболее близким к соединениям общей формулы I в ряду азопроизводных является бис(N,N-диметиламид)азодикарбоновой кислоты (диамид) формулы III:

оказывающий ингибирующее действие на базальную и NO-зависимую активность рГЦ [5].

Основным недостатком данного соединения является низкая эффективность ингибирующего действия на рГЦ (IC50 = 0,5-20 мМ).

Известны производные азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I, где m, n, x, y и z имеют вышеуказанные значения [6, 7, 8, 9].

Биохимические свойства данных соединений (в частности, способность ингибировать активность рГЦ) до настоящего времени не изучены.

Целью описываемого изобретения является поиск новых ингибиторов рГЦ, обладающих более выраженными биохимическими свойствами.

Указанная цель достигается применением известных производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I, где m, n, x, y и z имеют вышеуказанные значения в качестве ингибиторов рГЦ.

Согласно данному изобретению предпочтительно применение соединений общей формулы I, где m = n = x = 0, y = 2-12 и z = 1.

Предпочтительно применение производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I, где m = n = x = 0, y = 4 или 8 и z = 1 в качестве ингибиторов базальной активности и гем-независимой стимуляции рГЦ.

Предпочтительно применение производного азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I, где m = n = x = 0, y = 8 и z = 1, в качестве ингибитора NO-зависимой активации рГЦ.

Согласно данному изобретению предпочтительно применение следующих производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола):
- трис[1,2,5]оксадиазоло[3,4-c:3'4'-g:3'',4''-k][1,2,5,6,9,10] гексаазациклододецина (АОД-1);
- тетракис[1,2,5] оксадиазоло[3,4-c: 3'4'-g: 3'', 4''-k: 3''', 4'''-o] [1,2,5,6,9,10,13,14]октаазациклогексадецина (АОД-2);
- гексакис[1,2,5]оксадиазоло[3,4-c:3'4'-g:3'',4''-k:3''',4'''- o:3'''', 4''''-s: 3''''', 4'''''-w] [1,2,5,6,9,10,13,14,17,18,21,22] додекаазациклотетракозина (АОД-3);
- октакис[1,2,5] оксадиазоло[3,4-c:3'4'-g:3'',4''-k:3''',4'''- o:3'''', 4''''-s:3''''',4'''''-w:3'''''',4''''''a₁:3''''''',4''''''' е₁] [1,2,5,6,9,10,13,14,17,18,21,22,25,26,29,30] гексадекаазациклодотриаконтина (АОД-4);
- 4,4'-[азо-бис(1,2,5оксадиазол-4,3-диилазо)] бис(1,2,5-оксадиазол- 3-амина) (АОД-5);
- тетракис[1,2,5] оксадиазоло[3,4-b: 3'4'-f: 3'', 4''-j: 3''', 4'''-n] [1,4,5,8,9,12,13]оксагексаазациклопентадецина (АОД-6);
- тетракис[1,2,5] оксадиазоло[3,4-b: 3'4'-f: 3'', 4''-i: 3''', 4'''-m] [1,8,4,5,11,12]диоксатетраазациклотетрадецина (АОД-7).

Производные азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I были получены известным способом, основанным на реакции окислительной конденсации соответствующих производных 1,2,5-оксадиазоламина под действием дибромизоциануровой кислоты, тетраацетата свинца [6, 7, 8], гипогалогенитов щелочных металлов или ацетилгипогалогенитов [9].

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Ингибирующее действие производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I на базальную активность препарата очищенной рГЦ из легких крысы.

Препарат очищенной рГЦ из легких крысы был получен известным способом с модификациями. Легкие крысы (100 г) гомогенизировали с помощью блендера Уорринга в 300 мл 50 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,8, содержащего 5 мМ дитиотреитол (буфер A) три раза по 15 с. Центрифугировали полученный гомогенат при 10000g (4^oC, 20 мин). После центрифугирования супернатант отбирали и фильтровали через стекловату. Фильтрат центрифугировали при 100000g (4^oC 60 мин). Супернатант наносили на колонку с ионообменной смолой ДЭАЭ-Тойоперл 650М производства фирмы Тойосода, Япония, диаметром 1,5 см, высотой 40 см, уравновешенную буфером A, со скоростью тока жидкости 80 мл/ч. После промывки колонки с помощью буфера A до полного удаления не связавшегося с носителем белка, проводили элюцию рГЦ линейным градиентом NaCl (0-0.5 М) общим объемом 250 мл. Фракции, содержащие активность рГЦ, объединяли и концентрировали на мембране РМ-10 производства фирмы Амикон, Нидерланды, под давлением азота. Сконцентрированный препарат наносили на колонку со смолой Сефакрил S-300 производства фирмы Фармация, Швеция, диаметром 1,2 см, высотой 100 см предварительно уравновешенную буфером A, со скоростью тока жидкости 10 мл/ч. Фракции, содержащие активность рГЦ, объединяли и наносили на колонку с голубой сефарозой CL-4B производства фирмы Фармация, Швеция, диаметром 1,2 см, высотой 10 см, предварительно уравновешенную буфером A со скоростью тока жидкости 60 мл/ч. После промывки колонки с помощью буфера A до полного удаления не связавшегося с носителем белка. Проводили элюцию рГЦ буфером A, содержащим 0,5 М NaCl, со скоростью тока жидкости 60 мл/ч. Фракции, содержащие активность рГЦ, объединяли и концентрировали на мембране PM-10 производства фирмы Амикон, Нидерланды, под давлением азота. Сконцентрированный препарат хранили в присутствии 35% глицерина, 1,33 М NaCl при -70^oC. Активность фермента определяли по количеству образовавшегося цГМФ известным радиоизотопным способом с использованием [ α -³²P]ГТФ в качестве субстрата рГЦ.

Инкубационная смесь для определения активности (общий объем пробы 100 мкл) содержала 50 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 0,2 мМ ГТФ (200000 имп/мин [ α -³²P] ГТФ на пробу), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ креатинфосфат, 0,4 мг/мл креатинфосфокиназы, 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантин, 2 мМ цГМФ, ферментный препарат. Концентрация соединения в пробе составляла 1•10^-4 М, ДМСО - 0,2% об. В пробы вносили последовательно белок, инкубационную смесь и производные азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I, инкубировали 10 мин и затем начинали реакцию. Контрольная проба показала отсутствие влияния ДМСО в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали в термостате при 37^oC в течение 15 минут. Реакцию останавливали перенесением проб на 2 минуты в кипящую водяную баню. После соосаждения непрореагировавшего ГТФ под действием карбоната цинка и центрифугирования в полученном супернатанте определяли количество образовавшегося [³²P]цГМФ вышеуказанным способом с использованием хроматографии на колонках с кислой окисью алюминия. Определение белка проводили по способу Лоури, в качестве стандарта использовали человеческий сывороточный альбумин.

Производные азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I оказывали ингибирующее действие на базальную активность рГЦ. Так, эффективность ингибирующего действия АОД-2, АОД-3 и АОД-4 в концентрации 0,1 мМ при инкубации в присутствии 0,2 мМ дитиотреитола составляет 99, 48 и 84% соответственно, а в присутствии 10 мМ дитиотреитола: 49, 43 и 84% соответственно.

Пример 2. Ингибирующее действие производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I на активацию препарата очищенной рГЦ из легких крысы под действием протопорфирина IX.

Активность рГЦ измеряли так же, как описано в примере I, но инкубационная смесь содержала 1 мкМ протопорфирин IX, который добавляли через 10 мин инкубации в присутствии производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I.

Эффективность ингибирующего действия АОД-2, АОД-3 и АОД-4 в концентрации 0,1 мМ при инкубации в присутствии 0,2 мМ дитиотреитола составляет 99, 35 и 98% соответственно, а в присутствии 10 мМ дитиотреитола: 38, 38 и 77,4% соответственно.

Пример 3. Ингибирующее действие производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I на активацию препарата очищенной рГЦ из легких крысы под действием хлорида марганца.

Активность рГЦ измеряли так же, как описано в примере 1, но инкубационная смесь содержала 5 мМ MnCl₂, который добавляли через 10 мин инкубации проб в присутствии производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I.

Эффективность ингибирующего действия АОД-2, АОД-3 и АОД-4 в концентрации 0,1 мМ при инкубации в присутствии 0,2 мМ дитиотреитола составляет 92, 46 и 85% соответственно; эффективность ингибирующего действия АОД-2 и АОД-4 в присутствии 10 мМ дитиотреитола: 15 и 50% соответственно.

Пример 4. Ингибирующее действие производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I на базальную активность препарата рГЦ из легких крысы.

Препарат рГЦ из легких крысы получали известным способом. Активность рГЦ измеряли так же, как описано в примере 1.

Эффективность ингибирующего действия АОД-2 и АОД-4 в концентрации 0,1 мМ в присутствии 5 мМ цистеина составляет 24 и 55% соответственно. Эффективность ингибирующего действия АОД-2 в отсутствии тиолов составляет 73%.

Пример 5. Ингибирующее действие производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I на активацию препарата рГЦ из легких крысы под действием нитропруссида натрия.

Активность рГЦ измеряли так же, как описано в примере 1, но инкубационная смесь содержала 5 мМ цистеин и 0,1 мМ нитропруссид натрия, который добавляли через 10 мин инкубации проб в присутствии производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I.

Эффективность ингибирующего действия АОД-2 и АОД-4 в концентрации 0,1 мМ составляет 19 и 56% соответственно.

Как вытекает из данных примеров 1 и 4, соединения настоящего изобретения являются более эффективными ингибиторами базальной активности, чем их наиболее близкий структурный аналог - диамид, который ингибирует базальную активность рГЦ на 50% в концентрации 0,48 мМ в отсутствие дитиотреитола (ср. АОД-2 в концентрации 0,1 мМ ингибирует рГЦ на 99%). В присутствии дитиотреитола диамид ингибирует базальную активность рГЦ на 54% в концентрации 20 мМ (ср. АОД-4 в концентрации 0,1 мМ ингибирует рГЦ на 84%).

Кроме этого соединения настоящего изобретения оказывают выраженное ингибирующее действие на гем-независимую стимуляцию рГЦ под действием протопорфирина IX и ионов Mn²⁺, а также на гем-зависимую NO-опосредованную стимуляцию под действием нитропруссида натрия.

Таким образом, применение производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I в качестве ингибиторов рГЦ расширяет ассортимент эффективных модуляторов гем-независимой и гем-зависимой регуляции активности данного фермента.

Источники информации
1. Hobbs, A.J. "Soluble guanylate cyclase: the forgotten sibling" Trends in Pharm. Sci., 1997, v. 18, N 12, p. 487-491.

2. Tsai, S.-C., Adamik, R., et al. "Reversible inactivation of soluble liver guanylate cyclase by disulfides" Biochem. Biophys Res. Commun. 1981, v. 100 N 2, p. 637-643.

3. Wolbring, C. , Hollenberg M.D., Schnetkamp, P.P.M., "Inhibition of GTP-utilizing enzymes by tyrphostins" J. Biol. Chem., 1994, v. 269, N 36, p. 22470-22472.

4. "The chemistry of the hydrazo, azo and azoxy groups" Ed. Patai, S., part I, II, John Willey and Sons, 1975.

5. Craven, P.A., DeRubertis, F.R. "Effects of thiol inhibition on hepatic guanylate cyclase activity. Evidence for the involvement of vicinal dithiols in the supression of basal and agonist-stimulated activity" Biochim Biophys. Acta. 1978, v. 524, p. 231-244. - прототип.

6. Батог Л.В., Рожков В.Ю. и др. "Окислительная макроциклизация 3,4-диаминофуразана и 4,4'-диамино-3,3'-азофуразана под действием дибромизоцианурата. Кристаллические структуры гекса- и октадиазенофуразановых макроциклов". Известия РАН, серия химич., 1996, N 5, р. 1250-1254.

7. Sheremetev, A.B., Kulagina, V.O., Ivanova, V.A., "Zero-hydgogen furazan: Macrocycles with oxy and azo bridges". J. Org. Chem. 1996, v. 61, N 4, p. 1510-1511.

8. Epishina, M.A., Makhova, N.N., et al. "New macrocyclic systems - tetrafurazano[3,4-c: 3,4-e: 3,4-i: 3,4-k] -1,2,7,8- tetraazacyclododeca-1,3,5,7,9,11-hexane and hexafurozano-[3,4-c:3,4-e:3,4-i:3,4-k:3,4-o:3,4-r] -1,2,7,8,13,14- hexaazacyclooctadeca-1,3,5,7,9,11,13,15,17-nonane by oxidative macrocyclization of diaminodifurazanyl". Mendeleev Commun., 1994, N 3, p. 102-103.

9. Batog, L.V., Konstantinova, L.S., et al. "Hypohalites as reagents for the macrocyclization of diamines of the furazan series" Mendeleev Commun., 1996, N 5, p. 193-194.

Изобретение относится к биохимии, может быть использовано в биохимии для изучения регуляторных эффектов оксида азота и механизма действия рГЦ. Применяют производные азо-бис(1,2,5-оксадиазола) соответствующей структурной формулы I

где если m=0, то n=x=0, y=2-12 и z= 1, или n=x=y=1 и z=2, или n=x=z=1 и y= 3, или n=y=1, x=0 и z=2 или 3, или если m=1, то n=x=0, y=3 и z=1, в качестве ингибиторов растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ). Предпочтительно применение соединений общей формулы I, где m=n=x=0, y=2-12 и z=1. Предпочтительно применение производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I, где m= n=x=0, y=4 или 8 и z=1, в качестве ингибитора базальной активности и гем-независимой стимуляции рГЦ. Предпочтительно применение производного азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I, где m=n=x=0, y=8 и z=1, в качестве ингибитора NO-зависимой активации рГЦ. Соединения настоящего изобретения оказывают более выраженное ингибирующее действие на базальную активность и гем-независимую стимуляцию рГЦ под действием протопорфирина IX и ионов Mn²⁺, а также на гем-зависимую NO-опосредованную стимуляцию под действием нитропруссида натрия, превосходящее аналогичные эффекты известного структурного аналога - диамида. Расширяют ассортимент специфических регуляторов активности данного фермента. 3 з.п. ф-лы.

1. Применение производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) общей формулы I

где если m=0, то n=x=0, y=2-12 и z=1, или n=x=y=1 и z=2, или n=x=z=1 и y=3, или n=y=1, x=0 и z=2 или 3, или, если m=1, то n=x=0, y=3 и z=1,
в качестве ингибиторов растворимой формы гуанилатциклазы. 2. Применение производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) по п.1, где m-n=x= 0, y=2-12 и z=1. 3. Применение производных азо-бис(1,2,5-оксадиазола) по п.1, где m-n=x= 0, y= 4 или 8 и z=1, в качестве ингибитора базальной активности и гем-независимой стимуляции растворимой формы гуанилатциклазы. 4. Применение производного азо-бис(1,2,5-оксадиазола) по п.1, где m=n=x= 0, y=8 и z=1, в качестве ингибитора NO-зависимой активации растворимой формы гуанилатциклазы.