СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНОВ КАТАБОЛИЗМА ГЕРБИЦИДА 2,4-Д В ГЕНОМАХ ЭУКАРИОТ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/48 C12N15/09 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для обнаружения генов катаболизма гербицида 2,4-Д в геномах эукариот.

Известны способы тестирования генетических структур в клетках эукариот, в частности способ обнаружения глобиновых генов, способ тестирования Y-хромосом [1-2].

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ обнаружения глобиновых генов эукариот [1].

Способы обнаружения в геномах эукариот генов катаболизма 2,4-Д ранее не предлагались.

Цель данного изобретения - разработка способа обнаружения генов катаболизма гербицида 2,4-Д в геномах эукариот.

Поставленная цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу использование рекомбинантной плазмиды pМК16 в качестве молекулярного зонда позволяет обнаружить гены катаболизма 2,4-Д в геномах эукариот.

Способ основывается на особенности строения рекомбинантной плазмиды рМК16, заключающейся в том, что плазмида сконструирована из векторной молекулы pBR322 и генов биодеградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты.

Способ осуществляется выполнением следующих операций:
1. Получение препаратов ДНК из клеток эукариот.

2. Получение препарата ДНК pМК16.

3. Ферментативный гидролиз препаратов ДНК эукариот, фракционирование и перенос на мембранный фильтр.

4. Получение препарата радиоактивной ДНК pMK16.

5. Гибридизация препаратов геномной ДНК эукариот на фильтре с препаратом радиоактивной ДНК pMK16. Экспонирование мембранных фильтров с рентгеновской пленкой.

Сущность способа поясняется следующими конкретными примерами исполнения.

Пример 1. Получение препаратов ДНК из клеток эукариот.

Для получения препаратов ДНК растений посевной материал проращивают в течение 3 суток в термостате при оптимальной температуре (25 - 28^oC). 1-3 г проростков гомогенизируют с жидким азотом в фарфоровой ступке [3]. К гомогенату добавляют 21 мл буфера, содержащего 100 мМ Трис HCl pH 8, 15 мМ ЭДТА, 1% SDS. Суспензию инкубируют в течение 10 мин в водяной бане при 60^oC. Гомогенат охлаждают и к нему добавляют 5 M NaClO₄ до конечной концентрации 1 М, инкубируют во льду 30 мин. Далее к гомогенату дважды добавляют равный объем смеси фенол pH 8 - хлороформ (1:1), встряхивают в течение 20 мин на холодe. Супернатант отделяют центрифигурованием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Данную процедуру повторяют с хлороформом. Для получения осадка ДНК к супернатанту добавляют 2,5 объема этанола. Препарат ДНК собирают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, обрабатывают РНКазой А, депротеинизируют и переводят в буфер 10 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА. В таком виде используют в дальнейшем.

Для получения препаратов ДНК животных используют форменные элементы крови [4] . Гомогенат клеток в буфере 0,15 M NaCl - 0,015 М цитрат Na дважды депротеинизируют на холоде равными объемами фенолa pH 8 и один раз смесью хлороформ - изоамиловый спирт (24:1). Супернатант отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин. После депротеинизации ДНК обрабатывают РНКазой A, депротеинизируют и осаждают этанолом. Далее препараты переводят в буфер, содержащий 10 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА и в таком виде используют в дальнейшем.

Для получения препаратов ДНК грибов наращивают биомассу исследуемого штамма на агаризованной питательной среде. Массу (1-3 г) клеток снимают с агара шпателем и гомогенизируют в жидком азоте [5]. Далее проводят лизис клеток в присутствии 0,2% SDS при 60^oC в течение 10 мин. К лизату добавляют NaClO₄ до конечной концентрации 1 М. Смесь инкубируют во льду в течение 20 мин. Затем лизат дважды встряхивают с равным объемом смеси хлороформ-фенол pH 8 (1: 1) и один раз со смесью хлороформ-изоамиловый спирт (24:1). После этого к супернатанту добавляют 2,5 объема этанола и оставляют до образования осадка нуклеиновых кислот. Осадок собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин, растворяют в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl pH 7,4; 1 мМ ЭДТА, и в таком виде используют в дальнейшем.

Пример 2. Получение препарата рекомбинантной ДНК pMK16.

Препарат рекомбинантной плазмиды pMK16 получают из штамма E.coli HB 101 (pMK16) [5,6,7]. Для этого биомассу штамма E.coli HB 101 (pMK16) наращивают в 50 мл LB бульона с добавлением ампициллина до конечной концентрации 30 мкг/мл. Культуру инкубируют при 37^oC до достижения значения оптической плотности клеточной суспензии (ОД₆₀₀) 0,8 oE. Клетки собирают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, суспензируют в 1 мл буфера, содержащем 50 мМ глюкозы, 25 мМ Трис-HCl pH 8, 10 мМ ЭДТА. К суспензии клеток добавляют лизоцим до конечной концентрации 5 мг/мл и инкубируют во льду 7 мин. Затем к лизату добавляют 3 мл 0,2 M NaOH и 1% SDS, инкубируют до посветления лизата. Далее вносят 1,5 мл 5 M охлажденного ацетата калия. После 10-минутной инкубации в таящем льду лизат центрифугируют при 20000 об/мин при 4^oC 60 мин. К супернатанту добавляют РНКазу A до конечной концентрации 2 мкг/мл и инкубируют 40 мин при комнатной температуре. Смесь депротенизируют 2 раза фенолом pH 8 и 1 раз хлороформом. Нуклеиновые кислоты осаждают 2,5 объемами этанола, осадок собирают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, подсушивают на воздухе и растворяют в буфере 10 мМ Трис-HCl pH 8,1 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl. После этого проводят хроматографию препарата на сефарозе CL-2B. Фракции, содержащие ДНК, осаждают 2,5 объемами этанола. Осадок собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин, подсушивают, растворяют в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl pH 7,4; 1 мМ ЭДТА.

Для проверки структуры выделенной плазмиды 1 мкг ДНК pMK16 гидролизуют эндонуклеазой Bam HI в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl pH 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол в течение 2 ч при 37^oC. После гидролиза препарат рекомбинантной ДНК фракционируют методом электрофореза в 1,0% агарозном геле в трис-ацетатном буфере. В качестве маркера используют препарат ДНК фага λ, гидролизованный эндонуклеазой Pst I. В результате электрофореза убеждаются в том, что рекомбинантная плазмида состоит из трех фрагментов длиной 4,4; 3,1 и 1,3 т.п.н. Данный препарат используют для последующего анализа.

Пример 3. Ферментативный гидролиз препаратов ДНК эукариот, фракционирование и перенос на мембранный фильтр.

10 мкг препарата ДНК гидролизуют эндонуклеазой BamH I в 35 мкл буфера, содержащего 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl pH 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол в течение 2 ч при 37^oC. После этого полученные BamH I-фрагменты ДНК фракционируют в 1,2% геле агарозы методом электрофореза [7]. Для электрофореза используют буферную систему следующего состава: 20 мМ ацетата натрия, 40 мМ Трис-HCl pH 8,2 мМ ЭДТА pH 8. Фракционирование проводят в геле размером 120х80х5 мм, при токе 40-50 мА в течение 2-3 ч. В качестве маркера используют препарат ДНК фага λ, гидролизованный эндонуклеазой Pst I. По окончании электрофореза гель окрашивают в растворе этидум бромида и просматривают в ультрафиолетовом свете. По картине фракционирования маркерного препарата ДНК фага λ убеждаются в качестве фракционирования исследуемых препаратов ДНК. Далее гель помещают в раствор, содержащий 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl и инкубируют при комнатной температуре 60 мин. Гель промывают дистиллированной водой и помещают в раствор 1,5 M NaCl, 0,7 М Трис-HCl pH 8 на 60 мин. Далее гель промывают дистиллированной водой и проводят перенос фрагментов ДНК на мембранный фильтр с порами 0,2 мкм в потоке буфера, содержащем 10^xSSC, 1 мМ ЭДТА, в течение 18-20 ч. После данной процедуры фильтр подсушивают на воздухе и выдерживают при 80^oC в вакууме при 0,09 МПа в течение 2 ч. Фильтр инкубируют в растворе, содержащем 5^xSSC, 0,1% SDS, 5^x раствор Денхардта, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Фильтр выдерживают при 65^oC в течение 2 ч и далее используют для гибридизации с радиоактивным препаратом pMK16.

Пример 4. Получение препарата радиоактивной ДНК pMK16.

Препарат радиоактивной плазмиды pMK16 получают методом замещения нуклеотидов [7]. Для этого 0,5-1 мкг ДНК плазмиды pMK16 вносят в 20 мкл смеси, содержащей по 0,1 нМ дГТФ, -дТТФ, -дЦТФ, 100 пМ [α-³²P]-дАТФ; 0,1 М MgSO₄, 1 мМ дитиотрейтол, 500 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,5 М Трис-HCl pH 7,2. К смеси добавляют 1 мкл ДНК-полимеразы I (4'единицы) и 1 мкл ДНКазы I (2•10^-3 мг/мл). Смесь инкубируют 2 ч при 12^oC. Проверяют удельную активность зонда. Удельная активность зонда должна составлять 10⁵-10⁶ имп/мин на 1 мкг ДНК. Меченую плазмидную ДНК отделяют от свободного [α-³²P]-дАТФ на микроколонке с сефадексом G-50 (грубый). Препарат плазмиды денатурируют при 90^oC 3 мин, охлаждают во льду и используют для гибридизации.

Пример 5. Гибридизация препаратов геномной ДНК эукариот на фильтре с препаратом радиоактивной ДНК pMK16.

Препарат радиоактивной плазмидной ДНК pMK16 смешивают с буфером для гибридизации следующего состава: 5^xSSC, 0,001 М ЭДТА, 0,1% SDS, 5^x раствор Денхардта, 100 мкг/мл денатурированной ДНК лосося. В данную смесь помещают мембранный фильтр с иммобилизованными на нем препаратами геномной ДНК. Фильтр инкубируют при 65^oC в течение 16-18 ч. Затем фильтр обрабатывают дважды в буфере, содержащем 2^xSSC и 0,1% SDS при 65^oC в течение 2 ч и 0,5 ч в буфере, содержащем 0,2^xSSC и 0,1% SDS при 65^oC. Далее фильтр высушивают на воздухе при комнатной температуре и экспонируют с рентгеновской пленкой РМ-В и усиливающими экранами ЭУ-В2 в течение 3-7 сут. После проявления пленки проводят анализ гибридизации [7]. Положительная оценка гибридизации означает наличие генов катаболизма 2,4-Д в исследуемом образце.

Пример 6. Гибридизация препаратов геномной ДНК с препаратами радиоактивной ДНК pBR322.

Гибридизацию препаратов геномной ДНК с препаратами радиоактивной ДНК pBR322 проводят с целью исключения неспецифической гибридизации геномной ДНК с векторной молекулой pBR322, входящей в состав плазмиды pMK16.

Для гибридизации препаратов геномной ДНК с препаратами радиоактивной ДНК pBR используют метод гибридизации в точке [7]. Для этого 2 мкг каждого препарата исследуемой ДНК прогревают в течение 3 мин в водяной бане при 100^oC в буфере следующего состава: 5 мМ Трис pH 7,5; 0,1 мМ ЭДТА. Затем препарат быстро охлаждают во льду и наносят на мембранный фильтр. Препарат располагают на небольшой площади в виде точки. После подсушивания фильтра на воздухе его выдерживают 2 ч в вакуумном шкафу при 0,09 МПа и 80^oC. Далее фильтр используют для гибридизации ДНК, как указано в примере 5. Гибридизацию проводят с радиоактивным препаратом pBR322, который получают как описано в примере 4.

Пример 7. Экспериментальная лабораторная проверка способа обнаружения генов катаболизма гербицида 2,4-Д в геномах эукариот.

Лабораторная проверка предлагаемого способа проведена с использованием образцов ДНК различных эукариот. В число исследуемых были включены препараты геномной ДНК кукурузы Zea mays (Вир 44)(см. чертеж, поз. 4), пшеницы Triticum aestivum (сорт Московская 35)(поз. 2), гороха Pisum sativum (сорт Чишминский)(поз. 3), гриба Aspergillus niger van Zeghem (поз. 5), птицы Galliformes (домашняя порода кур)(поз. 1). Результаты исследований представлены на чертеже и в таблице.

Из чертежа и таблицы видно, что положительную гибридизацию с радиоактивной плазмидой pMK16, свидетельствующую о присутствии генов катаболизма 2,4-Д, имеют все исследованные препараты геномной ДНК эукариот. Гибридизационные полосы наблюдаются в области Bam HI-фрагментов длиной 4,4-4,5 т.п.н. Менее интенсивные гибридизационные полосы обнаруживаются с Bam HI-фрагментами, длина которых превышает 10 т.п.н. Кроме того, в препарате Aspergillus niger обнаружен гибридизирующийся Bam HI-фрагмент длиной менее 4,4 т.п.н. В таблице приведены также результаты контрольных экспериментов по гибридизации радиоактивной плазмиды pBR322 с геномной ДНК эукариот. Из данных таблицы видно, что молекулы вектора pBR322 не гибридизируются с исследуемыми препаратами эукариот и, следовательно, не могут оказать влияния на разрешающие возможности предлагаемого способа.

Таким образом, показано, что заявляемый способ позволяет обнаружить гены катаболизма в препаратах ДНК геномов эукариот.

Данный способ предлагается впервые.

Способ применим для анализа геномов различных представителей эукариот.

Способ применим для одновременного анализа значительного числа образцов ДНК.

Способ применим для молекулярного картирования геномов эукариот.

Таким образом, предлагаемый способ является новым, не имеет существенных ограничений в применении, расширяет возможности молекулярного картирования геномов эукариот.

Источники информации
1. Annual review of genetics, v. 14, 1980, p. 145-178.

2. The Y Chromosome. Part A: basic Characteristics of the Y Choromosome. Jau Yun-Fai. 1985, 177 c.

3. Генная инженерия растений. Ред. Дж. Драйпер, Р. Скотт, Ф.Армитидж, Р. Уолден, Москва, Мир, 1991, стр. 232-252.

4. Химия и биохимия нуклеиновых кислот. Ред. И.Б.Збарский, С.С.Дебов, Ленинград, Медицина, 1968, стр. 107-115.

5. Методы общей бактериологии. Ред. Ф.Герхард, Москва, Мир, 1984, стр. 112-118.

6. Патент РФ 2064501, 02.08.91. Т.В.Маркушева, В.С.Никитина, И.В.Кусова, М. Н.Султанбекова, Р.Н.Чураев, Е.Ю.Журенко, Е.Г.Каткова, Р.С.Шакирова "Штамм бактерий Escherichia coli, осуществляющий биодеградацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, рекомбинантная плазмидная ДНК pMK16, содержащая гены биодеградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pMK16, содержащей гены биодеградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты".

7. Молекулярное клонирование. Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Москва, Мир, 1984, стр. 332-337, 344-350.

Использование радиоактивного препарата ДНК плазмиды рМК 16 на твердом носителе позволяет обнаружить гены катаболизма гербицида 2,4-Д в ДНК геномов эукариотических клеток. 1 ил. 1 табл.

Способ обнаружения генов катаболизма гербицида 2,4-Д в геномах эукариот, заключающийся в гибридизации ДНК исследуемых образцов с радиоактивным препаратом ДНК плазмиды рМК16 на твердом носителе.