Диагностическая питательная среда для дифференциации возбудителя сибирской язвы по капсуло- и токсинообразованию Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/07 

Изобретение относится, в частности, к микробиологии, может быть использовано в медицине и ветеринарии для выявления возбудителя сибирской язвы и его дифференциации при исследованиях объектов внешней среды и инфицированных материалов. Изобретение может найти практическое применение в учреждениях Минздрава, Минобороны, МЧС России, занимающихся вопросами лабораторной диагностики сибирской язвы.

Наличие природных очагов сибирской язвы, ведущее к возникновению спорадических и массовых вспышек сибирской язвы среди сельскохозяйственных животных, приводящих к заболеваниям людей, обуславливает необходимость разработки методов выделения и идентификации возбудителя сибирской язвы. Для выделения сибиреязвенного микроба из объектов внешней среды существуют различные питательные среды, но лишь немногие из них позволяют проводить его дифференциацию от близкородственных сапрофитов и практически отсутствуют среды для одновременного выделения и разделения капсульных и бескапсульных штаммов В. anthracis.

Известна диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая, авторы Дармов И.В., Лазыкин А.Г., Строчков Ю.И. и др. - патент на изобретение №2289622. - 2004.

Для дифференциации капсулообразующих и бескапсульных штаммов В. anthracis авторы предложили агаризованную питательную среду на основе ферментативного гидролизата казеина с добавками фенолфталеинфосфата натрия и натрия двууглекислого. Среда позволяет проводить как межвидовую дифференциацию бактерий, так и внутривидовую капсулообразующих и бескапсульных штаммов сибиреязвенного микроба. Однако среда не дает возможности идентификации токсинпродуцирующих штаммов В. anthracis.

Известна плотная питательная среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы (СОПЭК), разработанная в СтавНИПЧИ, которая позволяет выявлять культуры, обладающие капсулообразующей способностью и продуцирующие экзотоксин. Еременко Е.И. Биологические и популяционные аспекты патогенности Bacillus anthracis: Дисс. … док. мед. наук. - Саратов (Ставрополь), 1997. - 275 с. Через 48 ч культивирования в атмосфере CO₂ продуцирующие капсулу культуры формируют на питательной среде колонии в SM-форме - округлые, гладкие, блестящие, со слизистым капсульным веществом на поверхности. В мазках из колоний обнаруживаются цепочки капсульных палочек. Не продуцирующие капсулу культуры растут в R-форме в виде шероховатых с волокнистым краем матовых сухих колоний.

Токсинообразование определяют по образованию вокруг колоний концентрических ореолов иммунопреципитации в виде мутно-белых тонких колец. Не продуцирующие токсин колонии лишены таких ореолов.

Недостатком указанной среды является сложный состав, включающий 18 аминокислот, соли, агарозу, бикарбонат натрия и иммуноглобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий (коммерческий). Кроме того, длительность получения результатов затягивается до 5 суток культивирования.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда для выделения и дифференциации возбудителя сибирской язвы по способности утилизировать D-сорбит. Патент на изобретение №2125610 Говорунова В.А., Мацаренко Г.В., Маринин Л.И., Степанов А.В. Плотная питательная среда для выявления возбудителя сибирской язвы.

По характеру роста и изменению окраски среды вокруг колоний можно дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы возбудителя сибирской язвы от близкородственных споровых сапрофитов.

Однако капсуло- и токсинообразование на данной среде не выявляются и срок культивирования составляет 36 ч.

Техническим результатом предлагаемой среды является повышение ее дифференцирующих свойств и способность сибиреязвенного микроорганизма продуцировать капсулу и экзотоксин на данной среде.

Технический результат достигается тем, что плотная питательная среда для одновременного капсуло- и токсинообразования содержит питательную основу, агар-агар, ускорители роста - L-аланин и инозин, натрий двууглекислый, натрия хлорид, сыворотку крупного рогатого скота, D-сорбит, бромтимоловый синий. Для ингибирования роста сопутствующей микрофлоры в среду вводится полимиксина сульфат.

Высев исследуемых штаммов (вирулентных, аттенуированных штаммов В. anthracis и близкородственных бактерий) проводят на предлагаемой питательной среде и культивируют при температуре 36±1°С в атмосфере CO₂ с последующим учетом образования капсулы через 24-30 ч роста культур.

Для определения образования токсина рядом с колонией выросшей культуры возбудителя сибирской язвы или близкородственных бактерий делают лунки, которые заполняют преципитирующей сибиреязвенной сывороткой или противосибиреязвенным иммуноглобулином. Токсинопродуцирующие культуры образуют линии преципитации. Учет образования токсина проводят через 24 ч.

Таким образом, время для учета капсуло- и токсинообразования на предлагаемой среде составляет 2-2,5 суток.

Возможность осуществления заявляемого изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Приготовление питательной среды.

В качестве основы берут агаровую питательную среду по Луриа-Бертани. Для приготовления агаровой среды в 1 л дистиллированной воды размешивают 10,0 г пептона (сухого питательного бульона), 5,0 г дрожжевого экстракта, 10,0 г натрия хлорида, 8,9 г L-аланина, 5,36 г инозина и 15,0 г агар-агара. Подогревают до полного растворения частиц. Среду разливают во флаконы (колбы) по 200 мл и стерилизуют автоклавированием при 1,0 атм (120°С) в течение 20 минут. Готовую среду хранят при температуре +2…8°С.

Готовят дополнительные ингредиенты:

- 20 г D-сорбита вносят в 80 мл стерильной дистиллированной воды, размешивают и кипятят 1-2 минуты.

- 1,6 г бромтимолового синего растворяют в 98,4 мл этилового спирта.

- инактивируют сыворотку крупного рогатого скота прогреванием при 56°С в течение 30 минут.

- 10% раствор натрия двууглекислого.

Перед применением агаризованную питательную среду расплавляют на водяной бане, охлаждают до температуры 45-50°С и на 200 мл добавляют 20 мл раствора D-сорбита (конечная концентрация 2%), 0,36 мл бромтимолового синего (0,003%), 20 мл инактивированной сыворотки крупного рогатого скота (20%), 10 мл 10% раствора натрия двууглекислого (1%) и 20000 Ед. полимиксина сульфат. Готовая питательная среда имеет синий с зеленоватым оттенком цвет (рН 7,2-7,4).

Пример 2. Использование питательной среды для дифференциации капсулообразующих штаммов В. anthracis и близкородственных сапрофитов (В. cereus).

На питательную среду в чашках Петри высевают исследуемую пробу или культуру (В. anthracis штаммы - И-363, 81-1, 47, СТИ-1, 34F2, 52/33, 71/12 и В. cereus штаммы - 95, 160, 127, 1408, в концентрации 1×10³/см³) и распределяют по поверхности среды шпателем с целью получения отдельных изолированных колоний. Чашки помещают в эксикатор вместимостью 5 дм³, в котором создают атмосферу CO₂. Можно использовать CO₂ инкубатор с содержанием углекислоты 10-25%. Через 24 ч культивирования при температуре 36±1°С визуально учитывают результаты по характеру роста микроорганизмов. Колонии капсулообразующих штаммов В. anthracis выпуклые, блестящие, гладкие, округлой формы, слизистой консистенции (SM-форма). В окрашенных по Ребигеру мазках из слизистых колоний палочки, окруженные слоем капсульного вещества. Колонии не образующих капсулу штаммов В. anthracis и штаммов В. cereus белесоватые, плоские, шероховатые, матовые (R-формы). В мазках, окрашенных по Ребигеру - цепочки бескапсульных палочек.

Пример 3. Выявление продукции экзотоксина.

Рядом с колониями выросшей культуры микроорганизмов (В. anthracis штаммы - И-363, 81-1, 47, СТИ-1, 34F2, 52/33, 71/12 и В. cereus штаммы - 95, 160, 127, 1408) на расстоянии 5-7 мм делают луночки, которые заполняют преципитирующей сибиреязвенной сывороткой (ФГУП Орловская биофабрика) или противосибиреязвенным иммуноглобулином. Чашки оставляют при комнатной температуре на 24 ч. При просмотре выявляют сформированные контурированные 1-3 линии преципитации со стороны роста токсинопродуцирующих культур В. anthracis. Линии преципитации отсутствуют со стороны роста не продуцирующих токсин культур В. anthracis, а также культур В. cereus.

Таким образом, предлагаемая питательная среда позволяет выявлять типичные сибиреязвенные штаммы и дифференцировать их от близкородственных микроорганизмов по продукции капсулы и экзотоксина. Кроме того, на питательной среде можно проводить внутривидовую дифференциацию сибиреязвенных штаммов по капсуло- и токсинообразованию. Предлагаемую питательную среду испытали при выделении микроорганизмов из инфицированной почвы и трупов животных. Эксперименты показывают не только возможность выделения сибиреязвенного микроба из контаминированных посторонней микрофлорой проб, но и одновременную межштаммовую и межвидовую дифференциацию возбудителя сибирской язвы.

Изобретение относится к микробиологии. Диагностическая питательная среда для дифференциации возбудителя сибирской язвы по капсуло- и токсинообразованию содержит сухой питательный бульон, дрожжевой экстракт, NaCl, агар-агар, L-аланин, инозин, 20 %-ный раствор D-сорбита, 1,6% раствор бромтимолового синего, 10%-ный раствор натрия двууглекислого, полимиксина сульфат, сыворотку крупного рогатого скота и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить дифференцирующие свойства питательной среды. 3 пр.

Диагностическая питательная среда для дифференциации возбудителя сибирской язвы по капсуло- и токсинообразованию, содержащая питательную основу, агар-агар, D-сорбит и рН-индикатор - бромтимоловый синий, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит ускоритель роста - L-аланин и инозин, субстрат для капсулообразования - сыворотку крупного рогатого скота, натрий двууглекислый и хлорид натрия, а также ингибитор роста сопутствующей микрофлоры полимиксина сульфат при следующем содержании компонентов:

сухой питательный бульон 10,0 г дрожжевой экстракт 5,0 г NaCl 10,0 г агар-агар 15,0 г L-аланин 8,9 г инозин 5,36 г D-сорбит 20% раствор 100,0 мл бромтимоловый синий 1,6% раствор 1,8 мл натрий двууглекислый 10% раствор 50,0 мл полимиксина сульфат 2000000 ЕД сыворотка крупного рогатого скота 100 мл дистиллированная вода 1 л