ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ СУХАЯ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической и ветеринарной микробиологии, наиболее эффективно может быть использовано для бактериологической диагностики возбудителя сибирской язвы из объектов внешней среды и инфицированного материала и может найти практическое применение в санитарно-эпидемиологических и научно-исследовательских учреждениях Минздрава, Минобороны, МЧС России, занимающихся вопросами лабораторной диагностики возбудителя сибирской язвы.

Сохранение природных очагов сибирской язвы, а следовательно, наличие высокой опасности возникновения болезни обуславливает необходимость совершенствования методов обнаружения и идентификации возбудителя сибирской язвы. Для идентификации и изучения свойств возбудителя необходимым этапом является выделение его чистой культуры на питательной среде (Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. - М,, 2002., Груз Е.В. Изучение и рационализация некоторых лабораторных методов индикации и идентификации В.anthracis. Автореф. дисс.канд. мед, наук. - Одесса, 1965).

Известна питательная среда (Маринин Л.И., Онищенко Г.Г. и др. Микробиологическая диагностика сибирской язвы. - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999), содержащая в качестве питательной основы - питательный бульон для культивирования микроорганизмов, витаминный препарат «ЭКД», минеральные вещества - динатрий фосфат и натрий углекислый, антибиотики триметоприм и полимиксин в качестве ингибиторов посторонней микрофлоры.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной питательной среды, относится то, что эта среда не позволяет выделять чистую культуру, оценивать морфологию колоний, проводить дифференциацию сибиреязвенного микроба от близкородственных сапрофитов, а также разделять капсульные (вирулентные) и бескапсульные (авирулентные) штаммы В.anthracis.

Известна плотная питательная среда, содержащая питательную основу, бромтимоловый синий, агар-агар и D-сорбит (RU, патент, 2125610 С1, кл. 6 С 12 Q 1/02, 1999).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной питательной среды, относится то, что эта среда сложна в приготовлении, имеет ограниченные сроки годности (не хранится, используется непосредственно по приготовлению), не содержит ингибиторов посторонней микрофлоры, не обладает способностью выявлять капсулу у В.anthracis.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению питательной средой по совокупности признаков является питательная среда элективная для выделения сибиреязвенного микроба сухая (АДЭСБ) (НИПЧИ г.Ростов-на-Дону), содержащая питательную основу, минеральные вещества, агар-агар, ингибитор роста сопутствующей микрофлоры и фенолфталеинфосфат натрия (временная фармакопейная статья 42-407ВС-93 «Питательная среда элективная для выделения сибиреязвенного микроба» сухая (АДЭСБ)»). В качестве питательной основы среда содержит пептон Д или ферментолизат, минеральные вещества - натрия хлорид и натрия карбонат, ингибиторы роста сопутствующей микрофлоры - триметоприм и полимиксина М сульфат при следующем содержании компонентов, г:

Пептон Д или ферментолизат12,0±2,0Агар-агар10,0Натрия хлорид6,0Натрия карбонат0,7Триметоприм0,05Полимиксина М сульфат0,05

Фенолфталеинфосфата натрия содержится в среде в виде 10%-ного раствора в аммиачном буфере.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной питательной среды, принятой за прототип, относится то, что состав данной среды не обеспечивает возможности выявления капсульных изолятов В.anthracis и не дифференцирует вирулентные и авирулентные штаммы возбудителя.

Технический результат - повышение дифференцирующих свойств питательной среды в отношении В.anthracis.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая, содержащая питательную основу, минеральные вещества, агар-агар, фенолфталеинфосфат натрия и ингибитор роста сопутствующей микрофлоры - полимиксина сульфат, дополнительно содержит натрий углекислый кислый, а в качестве питательной основы - ферментативный гидролизат казеина, в качестве источника минеральных веществ - натрий хлористый, калий хлористый, натрий фосфорнокислый 12-водный, при следующем количественном содержании компонентов, г:

Ферментативный гидролизат казеина34,00Натрий хлористый5,00Калий хлористый0,20Натрий фосфорнокислый 12-водный1,00Агар-агар20,00Полимиксина сульфат0,05Фенолфталеинфосфат натрия2,00Натрий углекислый кислый4,00

Только при вышеперечисленных составе и концентрациях компонентов диагностической питательной среды достигается указанный технический результат.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в таблице 1.

Изобретение позволяет повысить дифференцирующие свойства питательной среды в отношении В.anthracis за счет возможности проведения дифференциации капсулообразующих (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) форм возбудителя сибирской язвы.

Использование в составе заявляемой среды натрия углекислого кислого не ухудшает ее качества по селективным и элективным свойствам.

Возможность применения диагностической питательной среды для дифференциации капсульных (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) форм возбудителя сибирской язвы в пробах из объектов внешней среды и инфицирующего материала подтверждена нами экспериментальным путем и неизвестна из доступных источников информации.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами

Пример 1. Приготовление диагностической питательной среды

Диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая представляет собой набор, состоящий из основного компонента (флакон №1), содержащего питательную основу, натрий хлористый, калий хлористый, натрий фосфорнокислый 12-водный, агар-агар, фенолфталеинфосфат натрия, полимиксина сульфат и специфических добавок, представляющих собой 10% водный раствор аммиака (флакон №2) и натрий углекислый кислый (флакон №3).

Плотную диагностическую питательную среду готовят из сухой следующим образом.

Содержимое флакона №1 с основным компонентом размешивают в 0,8 дм³ дистиллированной воды, оставляют для набухания на 30...40 мин и затем кипятят в течение 5...10 мин до полного расплавления агара, фильтруют. Доводят объем среды до 1 дм³ дистиллированной водой. Значение рН-среды после смешения компонентов должно составлять 7,2±0,2. Стерилизуют автоклавированием при 120...125°С в течение (30±1) мин. Среду делят на две равные части по объему. Содержимое флакона №2 (натрий углекислый кислый) непосредственно вносят в колбу с 0,5 дм³ охлажденной до температуры (80...90)°С диагностической питательной средой и перемешивают до его полного растворения. Охлажденную до температуры 45...50°С среду разливают асептически по 15...20 см³ в стерильные чашки Петри с открытыми крышками, которые после застывания среды закрывают.

В качестве контрольной используют среду АДЭСБ (прототип), которую готовят в соответствии с «Инструкцией по применению питательной среды элективной для выделения сибиреязвенного микроба, сухой (АДЭСБ)» («Инструкция по применению питательной среды элективной для выделения сибиреязвенного микроба, сухой (АДЭСБ)», НИПЧИ г.Ростов-на-Дону, утверждена зам. министра МЗ РФ 19.07.1993 г.).

Для бактериологического контроля диагностической питательной среды, предназначенной для идентификации возбудителя сибирской язвы используют тест-штаммы В.anthracis СТИ-1, В. cereus 8, Pr.vulgaris 19, Е.coli 18 и В.anthracis Ч-7, полученные из ГИСК им Л.А.Тарасевича.

Пример 2. Использование диагностической питательной среды для выращивания В.anthracis.

Для определения ростовых свойств диагностической питательной среды, не содержащей натрий углекислый кислый, используют тест-культуру В.anthracis штамма СТИ-1, которую в количестве 0,1 см³ из разведения 10^-6 и 10^-5 (1·10² и 1·10¹ спор см^-3) по счету в камере Горяева наносят на поверхность среды (по три чашки Петри на каждую) и распределяют по поверхности среды покачиванием. Культуру выращивают в термостате при температуре (37±1)°С в течение (21±3) ч, после чего визуально производят учет результатов.

Сравнительная оценка ростовых свойств питательных сред представлена в таблице 2.

Из представленных в таблице 2 данных видно, что заявляемая среда обеспечивает рост типичных колоний в достаточном количестве и по своим ростовым свойствам не уступает прототипу.

Пример 3. Использование диагностической питательной среды для дифференциации (селекции) В.anthracis от сопутствующей микрофлоры.

Определение дифференцирующих (селективных) свойств диагностической питательной среды в отношении В.anthracis проводят следующим образом.

На 3 чашки Петри со средами, не содержащими натрий углекислый кислый, приготовленными согласно примеру 1, высевают по 0,1 см³ и 0,01 см³ смеси тест-культур: суспензии спор В.anthracis штамма СТИ-1 (1×10⁴ спор см^-3), Е.coli штамма 18 (1×10⁴ микробных клеток см^-3), Pr.vulgaris штамма 19 (1×10⁴ микробных клеток см^-3) с 0,9%-ным раствором хлористого натрия в соотношении 0,5:0,5:0,5:3,5. Смесь равномерно распределяют шпателем по поверхности среды. Чашки с засеянной смесью культур помещают в термостат и выдерживают при температуре (37±1)°С в течение 18...24 ч, после чего производят учет результатов.

Сравнительная оценка дифференцирующих (селективных) свойств заявляемой и средой прототипом представлена в таблице 3.

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что как заявляемая, так и среда-прототип, с одной стороны, ингибирует рост сапрофитов Pr.vulgaris 19. Е.coli 18, с другой, - не влияет на рост В.anthracis СТИ-1.

Пример 4. Использование диагностической питательной среды для дифференциации В.anthracis от близкородственных сапрофитов.

Определение дифференцирующих свойств проводят визуально, путем изменения окраски колоний тест-культур. Для чего смесь тест-культур в объеме 0,1 см³, состоящую из штамма СТИ-1 (1×10⁴ микробных клеток см^-3), В.cereus 8 (1×10⁵ микробных клеток см^-3) и 0,9%-ного раствора хлористого натрия в соотношении 0,5:0,5:4,0 высевают на питательные среды, приготовленные согласно примеру 1, в чашки Петри и равномерно распределяют по поверхности шпателем. Посевы инкубируют при (37±1)°С в течение 36...48 ч. Для выявления реакции на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри наносят 2...3 капли 10%-ного раствора аммиака (флакон №3), чашку закрывают и через 5...10 мин визуально проводят учет результатов по изменению окраски колоний. Реакция считается положительной, если колонии окрашиваются в ярко-розовый или малиновый цвет. Штамм СТИ-1 сибиреязвенного микроба не разлагает фенолфталеинфосфат натрия и его колонии не изменяют свой цвет. Колонии В.cereus 8 окрашиваются в ярко-розовый или малиновый цвет.

Сравнительная оценка дифференцирующих свойств заявляемой и средой-прототипом представлена в таблице 4.

Из представленных в таблице 4 результатов видно, что изученные среды, при выращивании B.anthracis штамма СТИ-1 и B.cereus 8, в равной степени обеспечивают межвидовую дифференциацию бактерий.

Пример 5. Использование диагностической питательной среды для дифференциации капсулообразующих (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) штаммов В.anthracis.

Определение капсулообразующей способности В.asthracis проводят на диагностической питательной среде, содержащей натрий углекислый кислый (приготовленной согласно примеру №1). Для проведения анализа необходим эксикатор.

Рабочую смесь тест-культур В.anthracis в объеме 0,1 см³, состоящую из штаммов СТИ-1 и Ч-7 по 20...50 спор каждого штамма в 0,9%-ном растворе хлористого натрия, высевают на поверхность питательной среды в чашках Петри. Чашки помещают в эксикатор вместимостью 5 дм³, на дно которого насыпают 4,6 г натрия углекислого кислого и наливают туда же 30 см³ 5%-ного (объем/объем) раствора серной кислоты и путем притирания плотно закрывают его крышкой. Культуру выращивают в течение 24...48 ч при (37±1)°С в термостате. Вместо эксикатора можно использовать СО₂-инкубатор с содержанием углекислого газа от 10 до 20% в воздушной смеси.

Учет результатов определения капсулообразующей способности В.anthraeis на питательной среде проводят визуально. Результаты представлены в таблице 5.

Из представленных в таблице 5 данных видно, что заявляемая среда, в отличие от прототипа, позволяет проводить дифференциацию капсулообразующих (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) штаммов сибиреязвенного микроба по морфологии их колоний.

Предлагаемая диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая характеризуется перед ранее известными средами следующими преимуществами:

- позволяет стабильно и эффективно проводить одновременно выделение и дифференциацию капсулообразующих (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) форм сибиреязвенного микроба;

- среда может быть использована для бактериологической диагностики возбудителя сибирской язвы из объектов внешней среды и инфицированного материала;

- среда обладает ингибирующими свойствами в отношении микробных сапрофитов;

- среда позволяет проводить как межвидовую дифференциацию бактерий (вид anthraeis от вида cereus), так и внутривидовую - капсулообразующих (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) штаммов сибиреязвенного микроба по цвету и морфологии их колоний;

- использование диагностической питательной среды предполагает ускорение процедуры выделения и идентификации сибиреязвенного микроба;

- сухая форма среды обеспечивает стабильность ее свойств в течение 2-х лет хранения при условии целостности упаковки в помещении с относительной влажностью воздуха не более 70% и температурой не выше 30°С.

Вышеперечисленные преимущества диагностической питательной среды позволяют использовать ее для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы и одновременной дифференциации его от близкородственных споровых бацилл, а также внутривидовой дифференциации между вирулентными капсулообразующими и авирулентными бескапсульными штаммами сибиреязвенного микроба.

Таблица 1
Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатомВиды технического результата и их размерностьПоказатели фактические или расчетныеПодробное объяснение за счет чего (отличительный признак и (или) их совокупность) стало возможным улучшение предлагаемого объекта по сравнению с прототипомПрототипа*Заявляемого объектаПовышение дифференцирующих свойств питательной среды в отношении В.anthracisНе проводит дифференциацию капсулообразующих и бескапсульных штаммы возбудителя сибирской язвыПроводит дифференциацию капсулообразующих и бескапсульных штаммов возбудителя сибирской язвыОбусловлено тем, что диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая дополнительно содержит натрий углекислый кислый, а в качестве питательной основы - ферментативный гидролизат казеина, в качестве источника минеральных веществ - натрий хлористый, калий хлористый, натрий фосфорнокислый 12-водный, при следующем количественном содержании компонентов, г:
питательная основа (с аминным азотом 3,5%) - 34,0;
натрий хлористый - 5,0;
калий хлористый - 0,2;
натрий фосфорнокислый 12-водный - 1,0;
агар микробиологический - 20,0;
полимиксина сульфат - 0,05;
фенолфталеинфосфат натрия - 2,0;
натрий углекислый кислый - 4,0* Примечание. В качестве прототипа выбрана среда АДЭСБ (НИПЧИ г.Ростов-на-Дону)

Таблица 4
Оценка дифференцирующих свойств питательных средНаименованиеШтаммРеакция на фосфатазную активностьДиагностическая питательная средаB.cereus 8+СТИ-1-АДЭСБ (прототип)B.cereus 8+СТИ-1-Примечание. Знак «+» или «-» означает наличие или отсутствие окрашиваемых колоний

Таблица 5
Оценка капсулообразующей способности В.anthracis на питательных средахНаименование и вид штамма В.anthracisПитательная средаКапсулообразованиеМорфология колонийСТИ-1 бескапсульный авирулентныйдиагностическая-Серовато-белые, шероховатые с матовой поверхностью и бахромчатой периферией колонии ("львиная грива")АДЭСБ (прототип)-4-7 капсулобразующий вирулентныйдиагностическая+Беловато-серые, прозрачные слизистые выпуклые гладкие колонии с ровными краями (S-форма)АДЭСБ (прототип)-Серовато-белые, шероховатые с матовой поверхностью и бахромчатой периферией колонии ("львиная грива")Примечание. Знак «+» или «-» означает наличие или отсутствие капсулообразования

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для бактериологической диагностики возбудителя сибирской язвы из объектов внешней среды и инфекционного материала. Среда содержит в качестве питательной основы ферментативный гидролизат казеина, натрий хлористый, калий хлористый, натрий фосфорнокислый 12-водный, агар-агар, полимиксина сульфат, фенолфталеинфосфат натрия, натрий углекислый кислый в заданном соотношении. Изобретение позволяет повысить дифференцирующие свойства питательной среды в отношении Bacillus anthracis. 5 табл.

Диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая, содержащая питательную основу, минеральные вещества, агар-агар, фенолфталеинфосфат натрия и ингибитор роста сопутствующей микрофлоры - полимиксина сульфат, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит - ферментативный гидролизат казеина, в качестве источника минеральных веществ - натрий хлористый, калий хлористый, натрий фосфорнокислый 12-водный, а также дополнительно содержит натрий углекислый кислый, при следующем количественном содержании компонентов, г:

Ферментативный гидролизат  казеина34,00Натрий хлористый5,00Калий хлористый0,20Натрий фосфорнокислый  12-водный1,00Агар-агар20,00Полимиксина сульфат0,05Фенолфталеинфосфат натрия2,00Натрий углекислый кислый4,00