СЕЛЕКТИВНАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ БАЦИЛЛ ГРУППЫ Bacillus cereus Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу приготовления и использованию микробиологической селективной дифференциально-диагностической среды для выделения возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis) и близкородственных бацилл группы Bacillus cereus. Селективная дифференциально-диагностическая среда предназначена для выделения В. anthracis при исследовании материала, подозрительного на обсемененность возбудителем сибирской язвы, а также для проведения дифференциации В. anthracis от культур других представителей группы Bacillus cereus. Данная среда также может быть использована при изучении материала, содержащего (подозрительного на содержание) близкородственные бациллы группы Bacillus cereus. Предлагаемая среда может применяться в практике лабораторий, занимающихся выделением и изучением культур возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл группы Bacillus cereus.

Известна селективная среда PLET для выделения В. anthracis следующего состава: агар на основе вытяжки из бычьего сердца - Heart Infusion Agar, 30000 Ед/л полимиксина сульфата В, 40 мг/л лизоцима, 300 мг/л этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), 40 мг/л таллия ацетата, рН 7,35 (Knisely R.F. Selective medium for Bacillus anthracis // J.Bacteriol. - 1966. - Vol.92. - №3. - P.784-786).

Недостатками данной среды являются ее высокая токсичность, обусловленная наличием в среде ацетата таллия (1-й класс опасности), отсутствие роста некоторых штаммов В. anthracis, нетипичная морфология колоний сибиреязвенного микроба, выросших на среде, проведение учета результатов после 48 часов инкубации посевов при 37°С.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является селективная дифференциально-диагностическая среда с фенолфталеинфосфатом натрия для выделения возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл группы Bacillus cereus, включающая питательный агар любого состава, обеспечивающий рост сибиреязвенного микроба (рН 7,2-7,4), ингибиторы роста сопутствующей микрофлоры: 25 мг/л полимиксина сульфата М, подавляющего рост грамотрицательных микроорганизмов, 25 мг/л триметоприма как ингибитора роста грамположительных бактерий, 100 мг/л натрия фенолфталеинфосфата, являющегося субстратом для действия фермента щелочной фосфатазы, в качестве дифференциально-диагностического компонента. Использование данной среды регламентировано методическими указаниями «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы» (МУК 4.2.2413-08 - М., 2008). Недостатки данной среды заключаются в отсутствии в ее составе антимикотического компонента, а также в необходимости дополнительной обработки посевов парами водного аммиака для проявления активности щелочной фосфатазы, что создает определенные трудности при проведении учета результатов, так как пары аммиака оказывают раздражающее воздействие на слизистые оболочки глаз и носоглотки.

Цель настоящего изобретения заключается в подборе компонентов для селективной дифференциально-диагностической среды, повышающих избирательность роста бацилл группы Bacillus cereus и дифференцирующие свойства среды, не требуя дополнительной обработки выросших на ней колоний парами аммиака, что исключает раздражающее его воздействие на слизистые оболочки глаз и носоглотки персонала, производящего исследования, упрощая учет результатов.

Предлагаемая среда в качестве питательной основы содержит агар Хоттингера (рН 7,3) в количестве 1 л, поставленная цель достигается введением в состав среды в качестве селективных компонентов цефтазидима и амфотерицина В, динатриевой соли пара-нитрофенилфосфата (p-NPP) как дифференциально-диагностической добавки при следующем содержании компонентов:

цефтазидим - 20 мг амфотерицин В - 10 мг динатриевая соль пара-нитрофенил фосфата (p-NPP) - 500 мг

Цефалоспорин III поколения цефтазидим обладает активностью в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий, подавляет рост сопутствующей микрофлоры и не оказывает влияния на рост бацилл группы Bacillus cereus.

Полиеновый антибиотик амфотерицин В, характеризующийся высокой антимикотической активностью, подавляет рост грибов.

Для дифференциации колоний возбудителя сибирской язвы от колоний близкородственных бацилл группы Bacillus cereus предлагается тест для обнаружения фермента щелочной фосфатазы, а в качестве субстрата для действия этого фермента - динатриевая соль пара-нитрофенилфосфата (p-NPP). Метод основан на гидролизе щелочной фосфатазой p-NPP с образованием пара-нитрофенола (p-NP), обладающего ярко-желтым цветом, не требует дополнительной обработки выросших на среде колоний парами аммиака для выявления ферментативной активности щелочной фосфатазы, что исключает раздражающее действие паров аммиака на слизистые оболочки глаз и носоглотки персонала, производящего исследования, упрощает учет результатов и является преимуществом предлагаемой среды.

Возбудитель сибирской язвы не образует щелочную фосфатазу, поэтому гидролиз p-NPP не происходит, и цвет агара вокруг колоний не изменяется. Спорообразующие сапрофиты группы Bacillus cereus, как правило, обладают фосфатазной активностью, в результате чего образуется p-NP, придающий толще агара вокруг колоний желтое окрашивание.

Способ приготовления селективной дифференциально-диагностической среды.

Селективную дифференциально-диагностическую среду готовят следующим образом. На первом этапе подготавливают основные растворы дифференциально-диагностического и селективных компонентов среды. Навеску p-NPP 500 мг помещают в пробирку, растворяют в минимальном объеме (до 1 мл) стерильной дистиллированной воды, прогревают на водяной бане при температуре 56°С в течение 30 минут. 1000 мг цефтазидима во флаконе растворяют в 10 мл стерильной дистиллированной воды. 50 мг (50000 ЕД) амфотерицина В во флаконе растворяют в 5 мл стерильной дистиллированной воды. Далее агар Хоттингера во флаконах расплавляют в кипящей водяной бане, затем охлаждают до 40-50°С. Перед розливом в чашки к 1 л агара добавляют 1 мл л p-NPP, 0,2 мл цефтазидима, 0,1 мл амфотерицина В из основных растворов. Приготовленную среду тщательно перемешивают, разливают в чашки Петри, подсушивают в течение 1,5-2 ч. Так как в состав среды включен раствор амфотерицина В, чашки со средой до использования следует поместить в защищенное от света место. Чашки со средой после розлива можно хранить в условиях холодильника 1-2 суток.

Готовят взвеси спор испытуемых штаммов возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis 81/1,5. anthracis СТИ-1 и близкородственных бацилл группы Bacillus cereus В. cereus 96, В. thuringiensis Ser. 5 с мутностью, равной 10 единицам отраслевого стандарта мутности ГИСК им. Л.А.Тарасовича, затем десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводят до концентрации 100 спор в 1 мл. Аналогичным образом готовят взвеси штаммов Staphylococcus aureus 209-P, Escherichia coli 11, Proteus vulgaris НХ-19 концентрацией 100 микробных клеток (м.к.) в 1 мл. Из данных разведении взвеси штаммов засевают 0,1 мл на поверхность агаровой пластинки опытной и контрольной сред, растирают микробиологическим шпателем. В качестве контрольной среды используют агар Хоттингера, рН 7,3. По одной чашке Петри каждой среды оставляют незасеянными. Посевы инкубируют 18-20 ч при температуре 37°С, после чего проводят оценку ростовых, селективных и дифференциально-диагностических свойств опытной среды. Колонии бациллярных штаммов (B. anthracis 81/1, В. anthracis СТИ-1, В. cereus 96, В. thuringiensis Ser. 5) имели типичную морфологию, цвет агара вокруг колоний В. anthracis 81/1 и СТИ-1 не изменился, толща агара вокруг колоний В. cereus 96, В. thuringiensis Ser.5 приобрела ярко-желтое окрашивание. Рост штаммов S. aureus 209-Р, Е. coli 11, Р. vulgaris HX-19 на агаровых пластинах экспериментальной среды отсутствовал. Незасеянные среды не изменили своего цвета. На агаре Хоттингера отмечен рост колоний всех тестируемых штаммов типичной морфологии.

Возможность осуществления предполагаемого изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Готовили среду следующего состава: агар Хоттингера, рН 7,3 - 1 л, цефтазидим - 10 мг, амфотерицин В - 5 мг, p-NPP - 250 мг. В колбу помещали пробу почвы (10 г), заливали физиологическим раствором (100 мл), добавляли по 0,1 мл взвесей штаммов В. anthracis СТИ-1, В. cereus 96, S. aureus 209-Р, Е. coli 11, P. vulgaris HX-19, перемешивали, засевали 0,1 мл на поверхность агаровой пластинки экспериментальной среды, растирали микробиологическим шпателем и, не обжигая его, делали посев переносом на вторую чашку с этой средой. Через 18-20 ч инкубирования при 37°С формировались колонии бацилл с характерной морфологией, которые можно было дифференцировать по тесту на щелочную фосфатазу: цвет агара вокруг колоний В. anthracis СТИ-1 не изменился, толща агара вокруг колоний В. cereus 96 и почвенных бацилл окрасилась в желтый цвет. Рост штаммов S. aureus 209-Р, Е. coli 11, Р. vulgaris HX-19 отсутствовал. Отмечен рост сопутствующих микроорганизмов, в том числе почвенных грибов.

Пример 2. Готовили среду следующего состава: агар Хоттингера, рН 7,3 - 1 л, цефтазидим - 18 мг, амфотерицин В - 8 мг, p-NPP - 490 мг. В колбу помещали пробу почвы (10 г), заливали физиологическим раствором (100 мл), добавляли по 0,1 мл взвесей штаммов В. anthracis СТИ-1, В. cereus 96, S. aureus 209-P, E.coli 11, P. vulgaris HX-19, перемешивали, засевали 0,1 мл на поверхность агаровой пластинки экспериментальной среды, растирали микробиологическим шпателем и, не обжигая его, делали посев переносом на вторую чашку с этой средой. Через 18-20 ч инкубирования при 37°С рост штаммов S. aureus 209-P, E. coli 11, Р. vulgaris HX-19 и почвенных грибов отсутствовал, цвет агара вокруг колоний с типичной морфологией штамма В. anthracis СТИ-1 не изменился, толща агара вокруг характерных колоний В. cereus 96 и почвенных бацилл приобрела ярко-желтое окрашивание в связи с активностью щелочной фосфатазы.

Пример 3. Готовили среду следующего состава: агар Хоттингера, рН 7,3 - 1 л, цефтазидим - 20 мг, амфотерицин В - 10 мг, p-NPP - 500 мг. В колбу помещали пробу почвы (10 г), заливали физиологическим раствором (100 мл), добавляли по 0,1 мл взвесей штаммов В. anthracis СТИ-1, В. cereus 96, S. aureus 209-P, E. coli 11, P. vulgaris HX-19, перемешивали, засевали 0,1 мл на поверхность агаровой пластинки экспериментальной среды, растирали микробиологическим шпателем и, не обжигая его, делали посев переносом на вторую чашку с этой средой. Через 18-20 ч инкубирования при 37°С формировались типичные колонии преимущественно бацилл, которые можно было дифференцировать по тесту на щелочную фосфатазу: цвет агара вокруг колоний В. anthracis СТИ-1 не изменился, толща агара вокруг колоний В. cereus 96 и почвенных бацилл приобрела ярко-желтое окрашивание.

Пример 4. Эксперимент проводили так же, как описано в предыдущих примерах, среду готовили, используя концентрации дифференциально-диагностического и селективных компонентов на 1 л агара Хоттингера в следующих пределах: цефтазидим - 22 мг, амфотерицин В - 12 мг, p-NPP - 510 мг. Результаты, полученные при проведении данного опыта, были аналогичны результатам, представленным в примере 3.

Полученные результаты, обобщенные в таблице 1, дали возможность определить оптимальный состав селективной дифференциально-диагностической среды для выделения возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл группы Bacillus cereus (пример 3), позволяющий ингибировать рост посторонней микробной флоры и надежно дифференцировать бациллярные штаммы.

Таким образом, на основании вышеизложенного можно сделать вывод о преимуществах предлагаемой селективной дифференциально-диагностической среды, содержащей агар Хоттингера (1 л) в качестве питательной основы, 18-22 мг/л цефтазидима, 8-12 мг/л амфотерицина В, 490-510 мг/л p-NPP. Преимущества среды определяются наличием селективных и дифференциально-диагностического компонентов в вышеуказанных концентрациях: цефтазидим обладает активностью в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий, подавляет рост сопутствующей микрофлоры и не оказывает влияния на рост бацилл группы Bacillus cereus, амфотерицин В ингибирует рост грибов, субстрат для действия щелочной фосфатазы p-NPP дает возможность проведения дифференциации колоний возбудителя сибирской язвы от колоний близкородственных бацилл группы Bacillus cereus, не требуя дополнительной обработки выросших на среде колоний парами аммиака для выявления ферментативной активности щелочной фосфатазы, исключая раздражающее его воздействие на слизистые оболочки глаз и носоглотки персонала, производящего исследования, упрощая учет результатов.

Изобретение относится к приготовлению и использованию микробиологической селективной дифференциально-диагностической среды для выделения возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis и близкородственных бацилл группы Bacillus cereus. Среда содержит агар Хоттингера в качестве питательной основы (1 л), цефтазидим (18-22 мг) и амфотерицин В (8-12 мг) для подавления роста сопутствующей микрофлоры и динатриевую соль пара-нитрофенилфосфата (p-NPP), который является субстратом для действия фермента щелочной фосфатазы, в качестве дифференциально-диагностической добавки в количестве 490-510 мг. Дифференциацию проводят по состоянию питательной среды: цвет агара вокруг колоний Вас.anthracis не изменяется, тогда как толща агара вокруг колоний близкородственных бацилл приобретает ярко-желтое окрашивание. Изобретение позволяет повысить избирательность роста бацилл группы Bacillus cereus и дифференцирующие свойства среды, исключить раздражающее воздействие паров аммиака на персонал, производящий исследования, облегчить учет результатов. 1 табл.

Селективная дифференциально-диагностическая среда для выделения возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл группы Bacillus cereus, содержащая питательную основу, дифференциально-диагностический и селективные компоненты, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы содержит агар Хоттингера (рН 7,3) в количестве 1 л, в качестве селективных добавок - цефтазидим и амфотерицин В, а дифференциально-диагностическим компонентом является динатриевая соль пара-нитрофенилфосфата (p-NPP) при следующем содержании компонентов, мг:
цефтазидим 18-22 амфотерицин В 8-12 динатриевая соль пара-нитрофенилфосфата (p-NPP) 490-510