СПОСОБ ИНДИКАЦИИ НАСЛЕДСТВЕННОГО КЛЕТОЧНО-ЛЕТАЛЬНОГО ЭФФЕКТА НЕКОНТРОЛИРУЕМОГО ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ IN VIVO ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДЕТЕЙ ИЗ ЗАГРЯЗНЕННЫХ РАДИОНУКЛИДАМИ РАЙОНОВ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов.

Следует отметить, что известны 2 формы гибели лимфоцитов: интерфазная и репродуктивная (или пролиферативная), определяющая наследственный клеточно-летальный эффект. Большинство исследований посвящены изучению интерфазной гибели лимфоцитов [1,2] , в то время как репродуктивную гибель в известных нам публикациях оценивают значительно реже, используя лишь метод клонирования [3] . Последний метод является трудоемким, дорогостоящим, требующим длительного культивирования лимфоцитов (10-14 дней). В то же время репродуктивная гибель характерна для клеток, существенно определяющих специфику лучевой болезни, среди которой лимфопения, инвалюция органов, богатых лимфоидными элементами, гибель стволовых клеток костного мозга и эпителия крипт кишечника [4].

Аналогом данного способа исследования является способ, предназначенный для учета интерфазной гибели клеток тимуса, селезенки и кишечника мышей при действии низких доз радиации [1], основанный на том, что 0,02%-ный раствор эритрозина Б инкорпорируется в мертвые клетки и окрашивает их в красный цвет. Учет эритрозин Б положительных клеток производится путем подсчета их о помощью микроскопа.

В работах других авторов [5,6] при использовании способа дифференциального окрашивания (DISC) была исследована in vitro радиочувствительность лимфоцитов от больных хроническим лимфоцитарным лейкозом. Выделенные лимфоциты периферической крови этих больных облучали, инкубировали в течение 4 суток, а затем способом дифференциальной окраски живых и мертвых клеток определяли гибель клеток. Результаты характеризовались воспроизводимостью как при повторных исследованиях одного образца, так и при исследовании различных образцов от одного больного.

Прототипом данного изобретения может быть способ, предложенный M.Fenech для проведения цитогенетического мониторинга популяций человека [2].

Указанный способ состоит в том, что использовали кровь здоровых доноров, полученную стерильно методом венопункции. После выделения лимфоцитов в градиенте фикол-верографина их витально окрашивали трипановым синим и автоматически подсчитыавали количество жизнеспособных лимфоцитов, после чего их использовали для культивирования. Индивидуальная культура, содержащая 1 млн лимфоцитов на 1 мл питательной среды, включающей 15% объема иноктивированной эмбриональной телячьей сыворотки, ФГА фирмы "Wellcome" в концентрации 5 мкг/мл, инкубировалась при 37^oС в течение 44 часов в атмосфере 10% двуокиси углерода. Затем в культуру вводили цитохолазин Б в концентрации 4,5 мг/мл культуральной смеси. Фиксацию культуры производили на 72-ом часу от начала культивирования абсолютным метанолом в течение 10 минут. Готовили по 2 препарата на культуру и окрашивали по Май-Грюнвальд Гимзой.

Однако данный способ не может быть использован в таком виде, так как он имеет ряд существенных недостатков.

1. Для проведения анализа с помощью описанного способа требуется как минимум 10 мл венозной крови. Столь большие объемы крови для данного анализа можно получить только с помощью достаточно болезненного для детей метода венопункции.

2. С помощью указанного способа может быть проведена только оценка интерфазной гибели лимфоцитов, т.е. жизнеспособности выделенных лимфоцитов до их культивирования.

3. Используемый способ не дает ответа на вопрос о том, как действует радиационный фактор на пролиферативные возможности клеток крови человека.

Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в том, что для проведения лечебных и профилактических мероприятий по раннему выявлению признаков хронического радиационного воздействия введено:
исследование частоты
а) репродуктивно погибших и
б) выживших при культивировании потомков хронически облучаемых in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов.

Сущность изобретения заключается в следующем:
для индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов ввели стерильный забор крови из пальца, микроскопическое исследование частоты репродуктивно погибших и выживших потомков хронически облучаемых in vivo лимфоцитов периферической крови, и при повышении количества погибших (соответственно, снижения количества выживших) лимфоцитов по сравнению с контрольными осуществляют индикацию наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов.

Способ реализован следующим образом.

Объектом исследования являлась культура лимфоцитов периферической крови 20 детей г. Калинковичи Гомельской области (уровень загрязнения по Cs-137 5 Ки/км²), а также контрольной группы детей и взрослых г. Минска.

Для постановки культуры использовали цельную кровь, полученную из пальца или методом венепункции. Порции крови в стерильных флаконах с гепарином доставляли к месту постановки эксперимента - в стационарный бокс, работу в котором вели с соблюдением всех правил асептики. Культивирование проводили с использованием модифицированного полумикрометода (7).

Удобство метода заключается в том, что для культивирования требуется небольшое, до 0.5 мл, количество цельной крови, которое может быть получено не только методом венепункции, но и из пальца.

Лимфоциты культивировали в течение 72 часов в 15% питательной среде, состоящей из среды RPMI 1640 фирмы "Вектор-Новосибирск", эмбриональной телячьей сыворотки, 0.2% фитогемагглютинина P фирмы "Difco". На 44 часу роста в культуру добавляли блокатор деления цитоплазмы - цитохолазин Б в концентрации 3.0-4.5 мкг/мл. На 72 часу от начала культивирования к 0.3 мл культуральной смеси, необходимой для проведения анализа пролиферативной гибели культуры, добавляли 0.5 мл сыворотки для предотвращения агрегации клеток, осторожно ресуспендировали культуру, добавляли 3-5 капель метиленового синего - индикатора погибших клеток. Через 30 минут окрашенную суспензию клеток наносили на предметное отекло и подсчитывали число метиленположительных интенсивно окрашенных в синий цвет погибших (Мс+) клеток на 100-200 полинуклеарных лимфоцитов, которые легко визуализировались под световым микроскопом о увеличением 20 х 16.5. Число погибших и выживших (неокрашенных) лимфоцитов выражали как процент (%) Мс+ (Мс-) клеток к общему количеству проанализированных клеток, что выражают следующими формулами

или

где
N_о - общее количество проанализированных лимфоцитов;
N - (N+) - число погибших (выживших) лимфоцитов.

Предложенный нами способ позволяет учитывать репродуктивно (пролиферативно) погибшие клетки, после 2-5 клеточных делений в культуре лимфоцитов, исходно полученных у хронически облучаемых. in vivo в течение всего постчернобыльского периода детей, постоянно проживающих в зоне радиоактивного загрязнения. Результаты такого анализа позволяют дать точную оценку наследственного клеточно- летального эффекта для потомков родительских лимфоцитов, которые в условиях цитохолазинового блока характеризуются четкими отличительными признаками. Лимфоциты-потомки имеют в 2-3 раза больший объем клеток и два или более ядра в одной цитоплазме. Таким образом, эти клетки являются морфологически хорошо различимыми, выжившими или погибшими через несколько клеточных делений лимфоцитами- потомками.

Данные табл. 1 и 2 свидетельствуют о том, что использование предложенной модификации, выявляет высокодостоверные различия уровня репродуктивной гибели клеток у детей г. Калинковичи и контрольных групп г. Минска.

Индивидуальное обследование показало статистически значимое повышение исследуемых показателей в опытных образцах по сравнению с контрольными (примерно в 4-5 раз). Количество репродуктивно погибших клеток у детей г. Калинковичи варьировало от 14.0 до 27.0 процентов среди лимфоцитов, претерпевших несколько делений, тогда как в контрольных группах у детей и взрослых эти показатели изменялись от 2.5 до 12.5%.

Анализ среднегрупповых показателей репродуктивной гибели лимфоцитов детей из опытной и двух контрольных групп также подтвердил это заключение: 21.0±0.6% у детей г. Калинковичи, 5.6±0.7 и 5.3±0.8 у детей и взрослых г. Минска. Следует отметить, что выбранные нами контрольные группы являются условно-контрольными, так как радиационно-экологическая обстановка в Минске также изменилась после катастрофы на ЧАЭС.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение о том, что:
1. результаты обследования детей, подвергающихся длительному неконтролируемому многокомпонентному радиационному воздействию разной интенсивности и продолжительности в районах, выпадения радиоактивных осадков, показали высокую эффективность индивидуальной и популяционной биоиндикации облучения по частоте репродуктивной гибели лимфоцитов периферической крови;
2. использование метиленового синего (Мс) позволило провести точный количественный учет живых (Мс-) и погибающих или погибших (Мс+) клеток, которые претерпели несколько делений в условиях цитокинетического блока в культуре лимфоцитов периферической крови;
3. наличие погибших лимфоцитов, находящихся в I, II, III и более клеточных циклах, показало, что после хронического облучения могут погибать не только непосредственно облученные клетки, но и их потомки.

Использование данного способа позволит:
1. по сравнению с венепункцией осуществлять забор крови у детей неинвазивно, снижая нервную и травматическую компоненты;
2. ускорить выявление выживших при культивировании потомков хронически облучаемых in vivo лимфоцитов периферической крови человека;
3. сократить время на выявление отдаленного эффекта действия о хронического облучения in vivo на потомство облученных клеток;
4. оценить косвенно пролиферативные возможности стволовых кроветворных клеток;
5. проводить профилактику и раннюю диагностику с целью выявления радиационных поражений организма.

Источники информации
1. T. Nomura, V.Kinuta, T.Hongyo, H.Nakajima & T.Hatanaka. Prograrnmed Cell Death in Whole Body & Organ Systems by Low Dose Radiation//Radiat. Res. -1992. -33: Supplement.-P. 109-123.

2. M. Fenech. The cytokinesis-block micronucleus technique: A detailed description of the method & its application to genoto-xicity studies in human populations//Mut.Res..- 1993.-285.-P.35-44.

3. Tales, A.D., van Dam, F.J., van Mossel, H., Schoemaker, H.M., Osterman-Golkar, S. , Uebel, Ch., Tang-, Y.S., Zwinderman, A.H. and A.T. NataraJ'an (1991) Use of the clonal assay for the measurement of frequencies of hprt mutants in T-lymphocytes from five control populations. Mutation Res., 253, 199-213. =20
4. Комар B.E., Ханоон К.П. Информационные макромолекулы при лучевом поражении клеток// М.:Атомиздат.-1980.-1760.

5. H. I. Hinkley, A. G. Bosanquet. The in vitro radiosensitivity of lymphocytesfrom chronic lymphocytic leukaemia using the differential staining sytotoxicity (DISC) assay. 1. Investigation of the method// Int. J. Radiat. Biol. -1992.-61, No. I. P. 103-110.

6. A. G.Bosanquet, H.I.Hinkley. Profound differences in the radiosensitivity of lymphocytes from patients with chronic lymp-hocytic leukaemia found by DISCassay: Abstr. sci. presentat. Meet Assoc. Radiat. Res., Cardiff, UK, 16-18 Apr.//Int.J.Radiat.Biol.-1991.-60, No. 6.- p. 947.

7. D.A.Hungerford. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood & the preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl//Stain.Techn.-1965.-v. 40.-P. 333-338.

Способ может быть использован в области биологии и медицины. Для проведения лечебных и профилактических мероприятий по раннему выявлению признаков хронического радиационного воздействия введено исследование частоты а) репродуктивно погибших и б) выживших при культивировании потомков хронически облучаемых in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов. Проводят стерильный забор крови, культивируют лимфоциты периферической крови в течение 72 ч в 15%-ной питательной среде, мазки витально окрашивают раствором 0,1%-ного метиленового синего. Способ позволяет учитывать репродуктивно погибшие клетки, после 2-5 клеточных делений в культуре лимфоцитов. Повышается точность оценки наследственного клеточно-летального эффекта для потомков родительских лимфоцитов, снижается травматичность при заборе крови, сокращается время на выявление отдаленного эффекта действия хронического облучения in vivo на потомство облученных клеток, проводится ранняя диагностика и профилактика радиационных поражений организма. 2 табл.

Способ индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов, включающий стерильный забор крови, культивирование лимфоцитов периферической крови в течение 72 ч в 15%-ной питательной среде с 0,2% фитогемагглютинина и добавлением блокатора деления цитоплазмы - цитохолазина Б в концентрации 3 - 4,5 мкГ/мл, витальное окрашивание раствором 0,1%-ного метиленового синего и микроскопирование, отличающийся тем, что стерильный забор крови производят из пальца, а микроскопически исследуют частоту репродуктивно погибших и выживших потомков хронически облучаемых in vivo лимфоцитов периферической крови и при повышении количества погибших (соответственно снижения количества выживших) лимфоцитов по сравнению с контрольными осуществляют индикацию наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов.