СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ ВОДНЫЙ РАСТВОР ЭРИТРОПОЭТИНА Российский патент 1999 года по МПК A61K38/22 A61K9/08 A61K38/22 A61K47/26 A61K47/02 A61K47/12 

Изобретение относится к получению стабильного препарата эритропоэтина, который используется в медицине для лечения анемий. Эритропоэтин - это гликопротеидный гормон, регулирующий количество эритроцитов в крови млекопитающих. Он является фактором терминальной дифференцировки эритроидных клеток-предшественников.

В организме он содержится в очень незначительных количествах и частично выводится с мочой. Организм человека очень чувствителен к изменению содержания этого гормона. Снижение его активности приводит к развитию анемии. Эритропоэтин является очень нестабильным веществом. Он может быть получен из мочи человека и с помощью методов генной инженерии.

Чтобы получить препарат стабильного эритропоэтина, необходимы стабилизирующие агенты. Это обусловлено тем, что лекарственные формы должны содержать следовое количество эритропоэтина на единичную дозу. При этом это количество эритропоэтина должно быть строго определено и активность его сохранена.

Единичная доза гормона в препаратах составляет десятки микрограммов и легко инактивируется такими факторами окружающей среды, как температура, влажность, кислород воздуха, наличие тяжелых металлов. Адгезия эритропоэтина к поверхности сосудов из стекла или пластика, которые предназначены для лекарственных растворов эритропоэтина, также приводит к потере его активности.

Известен препарат рекомбинантного эритропоэтина "Эритростим" (ВФС 42-2496-97), содержащий в качестве стабилизатора альбумин сыворотки крови человека. Недостатками данного препарата являются возможность контаминации инфекционными вирусами (ВИЧ, вирус гепатита и др.); аллергенность для лиц с повышенной чувствительностью к препаратам белков крови; нестандартность препаратов человеческого альбумина и возможность присутствия в них ингибиторов эритропоэза; высокая стоимость апирогенных препаратов человеческого альбумина.

Известны стабильные препараты эритропоэтина, содержащие по меньшей мере один стабилизатор, выбранный из группы, включающей полиэтиленгликоль, белки, сахара, аминокислоты, минеральные соли, органические соли и серосодержащие восстановители (1).

При этом в качестве сахаров препараты могут содержать моносахариды (ксилоза, манноза и др.), дисахариды (лактоза, мальтоза и сахароза), трисахариды (раффиноза), полисахариды (декстран, сахарный спирт - маннитол, сорбитол и глицерин) и циклитолы - инозитол. В качестве неорганических солей указаны такие, как KCl, CaCl₂, Na-фосфат, K-фосфат и Na-гидрокарбонат. В данном источнике информации не указана активность эритропоэтина, но содержание его в готовых формах составляет 0.1 - 50 мкг на единичную дозу, в том числе на 1 - 5 мл инъекционного раствора.

Исследования активности препаратов, полученных при использовании перечисленных стабилизаторов, проведенные с применением радиоактивных меток (¹⁴C), показали 87 - 99%-ную активность эритропоэтина после хранения препаратов в течение 2 месяцев. Эти препараты были получены из лиофилизатов путем растворения их в воде. Препараты, не содержащие стабилизатора, сохраняли 60% активности в течение двух месяцев. Однако, как показали дальнейшие испытания этих препаратов на мышах, стабилизированные препараты были неактивны (2).

Это объясняется тем, что определение активности эритропоэтина in vitro по уровню радиоактивности (¹⁴C) меченного продукта ничего не говорит о его стабилизации и устойчивости к деградации.

Известны препараты эритропоэтина, содержащие физиологически приемлемый буфер с добавлением 5 - 50 г/л карбамида и 1 - 50 г/л аминокислот (2). Указанные препараты сохраняют свою активность (100 - 200 ME на нг белка) в течение 1 года при хранении их при 0^oC и нескольких месяцев - при температуре окружающей среды. В том случае, когда препараты были получены из предварительно сублимированных растворов, то срок хранения полученных инъекционных растворов увеличивался вдвое.

Из известных препаратов наиболее близкими по составу к предлагаемому являются водные растворы эритропоэтина, содержащие в качестве стабилизатора декстран (1, 4). Однако из приведенных в этих документах экспериментальных данных следует, что количество декстрана в растворах не превышает 1 мас.%, что приводит к потере их активности в экспериментах in vivo.

Задачей изобретения является создание стабильного водного раствора эритропоэтина, не содержащего иммуногенных вспомогательных ингредиентов. Эта задача решена за счет использования в качестве стабилизатора низкомолекулярного декстрана с молекулярной массой 30000 - 60000 в концентрации 6 - 10 мас. %. Предложенный раствор содержит также цитрат натрия и лимонную кислоту для создания изотонии и pH 6.5 - 7.5. Количество эритропоэтина составляет 500 - 4000 ME на 1 мл раствора.

Раствор может быть получен добавлением цитрата натрия и лимонной кислоты к реополиглюкину до создания pH 6.5 - 7.5 и эритропоэтина в количестве 500 - 4000 ME на 1 мл с последующим стерилизующим фильтрованием. Раствор может дополнительно содержать глюкозу и/или маннит в количестве 5 мас.%.

Реополиглюкин - это известный плазмозаменяющий раствор (3). Он представляет собой 10%-ный раствор полимера глюкозы - декстрана молекулярной массой 30000 - 40000 с добавлением изотонического раствора NaCl. Известно, что реополиглюкин уменьшает агрегацию форменных элементов крови, способствует перемещению жидкости из тканей в кровяное русло. В связи с этим препарат повышает суспензионные свойства крови, уменьшает ее вязкость, способствует восстановлению кровотока в мелких капиллярах, оказывает дезинтоксикационное действие.

В отличие от известных препаратов (1, 4), содержащих декстран, концентрация декстрана в растворе эритропоэтина, составляющем предмет настоящего изобретения, по меньшей мере в 10 раз выше. Это позволило получить стабильные растворы, в которых активность эритропоэтина сохраняется в течение 2-х лет при хранении препарата в сухом темном месте при 2 - 8^oC. Биологическая активность растворов была определена в тестах in vivo на полицитемических мышах. При этом в случае испытаний на полицитемических мышах за единицу биологической активности in vivo принимали такое количество препарата, которое по сравнению с 1 ME Государственного стандартного образца эритропоэтина (ГСОЭ) давало такую же величину процента включения радиоактивного железа в эритроциты полицитемических мышей после введения препарата. Полученные значения активности в сравнительном аспекте с активностью известного препарата "Эритростим" и международного стандарта представлены на фиг. 1. Международный стандарт эритропоэтина описан в (5). Видно, что активность полученных растворов превышает активность "Эритростима" и находится на уровне международного стандарта.

Полученные растворы для хранения помещают в ампулы из нейтрального стекла или стеклянные флаконы из дрота вместимостью 3 - 5 мл, или флаконы из нейтрального стекла емкостью 50 мл. Ампулы и флаконы закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками.

Методом твердофазного иммуноферментного анализа была определена концентрация эритропоэтина в готовых лекарственных формах (водные растворы) после их получения и по истечении 2-х лет хранения. Результаты этого анализа представлены на фиг. 2. Анализ показал, что концентрация эритропоэтина в одном растворе после хранения при 8^oC в течение 2-х лет составляет 96% от номинальной.

Расчет концентрации эритропоэтина в готовой лекарственной форме проводили, исходя из значения оптической плотности субстанции при 280 нм с коррекцией на светорассеяние при 400 нм, например
c = 1,34(A₂₈₀ - A₄₀₀)k,
где c - рассчитываемая концентрация эритропоэтина,
A₂₈₀ - значение поглощения при 280 нм,
A₄₀₀ - значение поглощения при 400 нм,
1,34 - коэффициент экстинкции эритропоэтина (значение оптической плотности при 280 нм раствора с концентрацией 1 мг/мл,
k - фактор разведения субстанции, определяемый с учетом удельной активности препарата, т. е. такое число, во сколько раз нужно развести субстанцию для получения значения 2000 ME/мл.

Было установлено, что 2000 ME препарата соответствуют 15 мкг эритропоэтина с удельной активностью 135000 ME/A₂₈₀.

Полученные прозрачные и бесцветные водные растворы эритропоэтина были испытаны на пирогенность. При дозе 1000 ME на 1 кг массы кролика препарат был апирогенным, что соответствовало требованиям ГФ XI, вып. 2, стр. 183. При внутривенном введении препарата мышам в дозе 20000 ME на 1 кг массы тела не было отмечено его токсичности, что соответствует ГФ XI, вып. 2, стр. 182.

Пример N 1.

К реополиглюкину добавляют натрия цитрата и лимонную кислоту с доведением pH раствора до 6.5 - 7.5 и затем добавляют субстанцию эритропоэтина. Полученный раствор подвергают стерилизующему фильтрованию с использованием фильтровальных элементов Millex (Millipore) (0.22 мкм). Составы полученных прозрачных и бесцветных растворов приведены в таблице.

Пример N 2.

Раствор с дополнительным содержанием 5% глюкозы получают аналогично примеру N 1, используя вместо реополиглюкина известный препарат "реополиглюкин с глюкозой", который также является плазмозаменяющим раствором (3).

Пример N 3.

Раствор с дополнительным содержанием 5% маннита получают аналогично примеру N 1, используя вместо реополиглюкина известный препарат
Пример N 4. Определение биологической активности раствора в полицитемических мышах.

За единицу биологической активности in vivo принимают такое количество препарата, которое по сравнению с 1 ME Государственного стандартного образца эритропоэтина (ГСОЭ) дает такую же величину процента включения радиоактивного железа в эритроциты полицитемических мышей после введения препарата.

1. Получение полицитемических мышей. Мышей-самок F1 (CBA/C57BL) в возрасте 7 - 9 недель содержат после доставки из питомника 6 - 10 дней в стандартных условиях вивария, а затем выдерживают в барокамере при пониженном давлении следующим образом: 1-ый день - 0.7 атмосферы, 2-й день - 0.5 атмосферы, с 3-го по 14-ый день - 0.4 атмосферы в течение 18 часов ежедневно с последующим содержанием при нормальном давлении в течение 6 часов. После этого в течение 3 дней до введения образцов эритропоэтина мыши содержатся в обычных условиях.

2. Введение образцов эритропоэтина. Мышей взвешивают и рассаживают в клетки по 6 животных в каждой. Государственный стандартный образец эритропоэтина (ГСОЭ) растворяют в 10% растворе реополиглюкина до концентрации 10 ME/мл. Из полученного раствора и ГСОЭ методом разведения готовят по 10 мл растворов со следующими концентрациями: 1.0; 0.6; 0.3; 0.15 ME/мл. Каждой группе мышей внутрибрюшинно вводят по 0.5 мл раствора одной из концентраций. Для исследуемого раствора используют не менее 3-х вышеуказанных концентрацией. Контрольной группе мышей вводят 0.5 мл 10% раствора реополиглюкина. Процедуру введения растворов всем группам мышей повторяют через 24 часа.

3. Введение радиоактивного железа (⁵⁹Fe). Через 24 часа после повторного введения образцов эритропоэтина каждому животному внутрибрюшинно вводят от 0.5 до 1.1 мкKu ⁵⁹Fe (цитрата, аскорбината или хлорида), разведенного в 0.9% растворе натрия хлорида с 0.3% натрия цитрата. Через 48 часов после введения препарат ⁵⁹Fe животных наркотизируют нембуталом. Кровь на счет и оценку гематокрита берут путем разрезания кожи в подмышечной области, образования кармана рассечения сосудов или путем декапитации. Гематокрит измеряют на приборе Целлокрит (Швеция) или аналогичном. Животных, гематокрит у которых ниже 53%, исключают из оценки результатов. Для подсчета метки на счетчике гамма-излучения (Гамма-трак, США или аналог) у каждого животного берут не менее 0.2 мл крови.

4. Обработка результатов. Процент включения метки в крови животного рассчитывают по следующей формуле:

где n - число импульсов/мин взятого объема крови;
M - вес тела, г;
0,08 - коэффициент пересчета общего объема крови в зависимости от веса тела, мл/г;
m - число импульсов/мин введенного животному количества препарата ⁵⁹Fe;
V - взятый объем крови, мл.

Методом регрессионного анализа рассчитывают зависимость между логарифмом концентрации исследуемого раствора и ГСОЭ и процентом включения метки. Составляя регрессионную зависимость для исследуемого раствора с такой же зависимостью для ГСОЭ, рассчитывают коэффициенты соотношения номинальных концентраций исследуемого раствора и соответствующих им по эффективности концентрации ГСОЭ.

K_i = Y_i / X_i,
где K_i - коэффициент соотношения концентраций ГСОЭ/исследуемый раствор при разведении i;
X_i - номинальное значение концентрации исследуемого раствора при разведении i (X_i = 1.0; 0.5; 0.2; 0.1), ME/мл.

На основании как минимумам трех вычисленных коэффициентов определяют его среднее значение:

где K_ср - средний коэффициент соотношения концентраций ГСОЭ/исследуемый раствор;
K1, 2, 3, 4 - коэффициенты соотношения концентраций ГСОЭ при определенном разведении исследуемого раствора (3-4 точки);
3(4) - количество взятых для сравнения с ГСОЭ концентраций исследуемого раствора.

Если различия в индивидуальных значениях K_i отличались от среднего значения K_ср более чем на 15%, тест повторялся. Умножив номинальное значение активности исследуемого раствора (A_ном) на средний коэффициент (K_ср), получают действительное значение активности (A_д) в ME/амп:
A_д = K_ср • A_ном.

Полученное значение активности не должно отличаться от номинального значения более чем на 20%. Результаты испытаний представлены на фиг. 1.

Примечание.

Приготовление 0.3% раствора цитрата натрия в 0.9% растворе хлорида натрия. В 100 мл 0.9% раствора хлорида натрия растворяют 0.3 г цитрата натрия (ГОСТ 22280-76). Готовят перед употреблением.

Пример N 5. Определение концентрации эритропоэтина (РЭЧ) твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА).

Реагенты и растворы:
ФСБ (фосфатно-солевой буфер) - 10 мМ натрия фосфат pH 7.4, 150 мМ натрия хлорид;
ФСБТ-ФСБ содержащий 0.05% Tween 20
Инкубационный буфер - ФСБТ содержащий 5 мг/мл белка (желатин, бычий сывороточный альбумин);
Посадочный буфер - ФСБ или 20 мМ натрия карбонат (1.95 г/Na₂CO₃, 2.66 г NaHCO₃) pH 9.3, содержащий 100 мМ натрия хлорид;
Блокирующий раствор - ФСБ, содержащий 10 мг/мл белка (желатин, бычий сывороточный альбумин);
Пероксидазный субстрат (исходный раствор):
- 40 мМ ABTS (2,2'-азино-бис(бензтиазолино-6-сульфонат) - растворитель 0.55 г ABTS в 25 мл дистиллированной воды, pH 6.0. Хранят в холодильнике во флаконе темного стекла.

- 50 мМ цитратный раствор - растворяют 9.6 г лимонной кислоты в 1000 мл дистиллированной воды, довести pH до 4.0 1.0N NaOH, охлаждают.

- 30% H₂O₂ (перекись водорода);
- Субстратный раствор (рабочий) на один микротитровальный планшет, готовят непосредственно перед употреблением (не ставят на свет и не добавляют консерванты);
цитратный раствор - 10 мл
ABTS - 50 мкл
H₂O₂ - 4 мкл
- анти-РЭЧ моноклональные антитела H6C7.

- конъюгат РЭЧ с пероксидазой хрена.

Приготовление планшетов
- Для приготовления микротитровального планшета растворяют 20 мкг анти-РЭЧ моноклональных антител в 10 мл ФСБ, разливают 100 мкл аликвоты в лунки планшета.

Инкубируют 1 час при 30^oC.

Добавляют блокирующий раствор (100 мкл в лунку), инкубируют 45 мин при 30^oC во влажной камере;
Отмывают планшет 4 раза ФСБТ.

Определение концентрации РЭЧ в готовой лекарственной форме:
- Приготовляют серийные разведения ГСОЭ (с шагом 1/2) в инкубационном буфере в диапазоне от 2 до 250 нг/мл;
- Переносят 50 мкл аликвоты в дубликатах в колонки планшета;
- Приготовляют несколько разведений образцов лекарственной формы в инкубационном буфере;
- Добавляют 50 мкл аликвоты в дубликатах в лунки планшета с нанесенными моноклональными антителами;
- Инкубируют 15 мин при 30^oC во влажной камере;
- Добавляют 50 мкл аликвоты коньюгата в двойной концентрации.

- Инкубируют 45 мин при 30^oC во влажной камере;
- Отмывают 4-6 раз ФСБТ при тщательном встряхивании;
- Добавляют 100 мкл пероксидазного субстрата в лунку. Дать окраске развиться 15-30 мин. при постоянном легком встряхивании;
- Измеряют поглощение при 414 нм;
- Строят график зависимости оптической плотности (ось Y) от log₂ концентрации ГСОЭ (ось X) для получения калибровочной кривой;
- Находят значение концентрации РЭЧ в образцах по соответствующему значению оптической плотности на калибровочной кривой.

Отношение биологической активности РЭЧ (в ME) к концентрации, измеряемой в миллиграммах, должно быть не ниже 100000.

Результаты исследований представлены на фиг. 2, где для сравнения приведены результаты аналогичных испытаний для известного препарата "Эритростим". Таким образом, результаты исследований полученного препарата свидетельствуют о сохранении активности эритропоэтина и отсутствии его разложения в процессе длительного хранения.

Активность нового препарат - на уровне известного препарата "Эристростим", в отличие от которого он не содержит вспомогательных компонентов, создающих нежелательные побочные эффекты и может быть получен с меньшими материальными затратами.

Список литературы
1. EP-A-0178665, 23.12.86.

2. US-A-4992419, 12.02.91.

3. М. Д.Машковский. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1986, ч.2, с. 101-102.

4. EP-A-0178576, 24.04.86.

5. Pharmeuropa B10 97-1.

Список сокращений
РЭЧ рекомбинантный эритропоэтин человека
ВИЧ вирус имунодефицита человека
ГСОЭ Государственный стандарный образец эритропоэтина
ФСБ фосфатно-солевой буфер
ABTS (2,2'-азино-бис(бензатиоазолино-6-сульфонат))з

Изобретение относится к новому стабильному препарату эритропоэтина и может быть использовано в медицине для лечения анемий. Предложен водный раствор, содержащий в 1 мл 500-4000 ME эритропоэтина, декстран с мол.м. 30000-60000 в концентрации 6-10 мас.%, цитрат натрия и лимонную кислоту для создания изотонии и pH раствора 6,5-7,5. Раствор может дополнительно содержать 5 мас.% маннита или глюкозы. Изобретение позволяет достичь срока годности раствора - до двух лет при хранении в условиях 2-8^oC. 2 з.п. ф-лы, 2 ил. , 1 табл.

1. Стабильный водный раствор эритропоэтина, содержащий декстран, отличающийся тем, что он дополнительно содержит цитрат натрия и лимонную кислоту для создания изотонии и рН 6,5 - 7,5, при концентрации декстрана 6 - 10 мас. %, его мол.м. 30000 - 60000 и активности эритропоэтина 500 - 4000 МЕ на 1 мл раствора. 2. Раствор по п.1, отличающийся тем, что он получен добавлением цитрата натрия и лимонной кислоты к реополиглюкину для создания рН 6,5 - 7,5 и эритропоэтина в количестве 500 - 4000 МЕ на 1 мл с последующим стерилизующим фильтрованием. 3. Раствор по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит глюкозу или маннит в количестве 5 мас.%.